端粒酶(telomerase)是能以自身RNA为模板合成端粒DNA的逆转录酶,其主要作用是维持染色体末端端粒(telomere)的长度以保持染色体的稳定性。人端粒酶主要由两个部分组成,人端粒酶RNA模板(human telomerase RNA, hTR)和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。研究证实,端粒酶与恶性肿瘤的发生发展关系密切,而在这个过程中,hTERT作为端粒酶的限速酶发挥了关键作用,但是其表达调控机制尚不完全明确。本论文主要从以下三个方面研究hTERT启动子在恶性肿瘤发生发展过程中的调控机制及其在肿瘤诊断中的潜在应用：(1)hTERT启动子DNA甲基化,(2)hTERT启动子突变,(3)hTERT的转录调控机制。第一部分hTERT启动子DNA甲基化在胃肠道恶性肿瘤诊断中的研究背景胃肠道恶性肿瘤(gastrointestinal cancer,GIC),主要包括胃癌(gastric cancer, GC)和结直肠癌(colorectal cancer,CRC),是最常见的恶性肿瘤之一。目前内镜活检是诊断GIC的主要手段,但是内镜检查是有创性检查且价格昂贵。基于粪便的无创性检查方法是更易于被接受的GIC筛查和术后复发监测的手段。越来越多的研究者致力于研究粪便中肿瘤标记物在GIC诊断中的应用。与易于降解的mRNA和蛋白相比,DNA甲基化更为稳定,是更为可靠的疾病检测标记物。DNA甲基化(DNA methylation)是人类基因表观遗传学(epigenetics)的主要修饰方式之一,以往的很多研究揭示了多种基因如CDH1、P16、hMLH1、MGMT、 RASSF2等异常甲基化与GC和CRC的关系。同时,也有研究报道在CRC患者血清和粪便标本中发现了多种基因启动子区域DNA的异常甲基化,例如SEPT9、 RASSF2、SFRP2等,都有可能做为CRC患者无创性诊断的分子标记物。多项研究表明,在包括GIC在内的90%以上的人类恶性肿瘤细胞中,存在hTERT mRNA的过表达和端粒酶的异常活化。作为端粒酶的催化亚基,hTERT的表达水平在很大程度上决定了端粒酶的活性。hTERT启动子富含CpG二核苷酸,即存在CpG岛(CpG islands)。研究发现,hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞之间呈现出不同的甲基化状态,这使得hTERT启动子DNA甲基化可能作为一种潜在的分子标记物用于疾病检测。已有研究报道,GC和CRC肿瘤组织中的hTERT启动子DNA甲基化水平高于癌旁正常组织,且甲基化水平与hTERT mRNA的表达水平密切相关。但尚未有研究报道粪便中hTERT启动子DNA甲基化的情况。目的阐明GIC患者肿瘤组织和粪便中hTERT启动子DNA甲基化的水平,探讨粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平是否可以作为GIC诊断和监测的指标。方法本研究收集了34例GC和CRC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织标本,69例GC和CRC患者的粪便标本,以及62例非肿瘤患者的粪便标本。肿瘤患者的粪便标本均在接受治疗前获取,并即刻于-80℃C冻存。分别提取组织和粪便中的基因组DNA,然后进行重亚硫酸盐转化(bisulfite conversion)并纯化,采用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术定量检测组织和粪便中hTERT启动子2个CpG位点的甲基化水平。统计分析GC和CRC患者粪便中CpG位点甲基化水平与患者年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性等临床病理资料之间的相关性,分析该方法对GC和CRC诊断的敏感性和特异性。结果GIC肿瘤组织和癌旁正常组织中hTERT启动子的2个被检测CpG位点Site1和Site2的甲基化水平均具有显著性差异(P=0.008和P=0.004)。GIC患者粪便中Sitel和Site2的甲基化水平显著高于非肿瘤患者(P<0.05)。将Site1和Site2的甲基化水平取平均值Avg,受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,对所有的GIC患者,Site1、Site2、Avg的曲线下面积(AUC)依次为0.769、0.777、0.799。GC和CRC患者粪便中Site1和Site2的甲基化水平没有显著性差异,且甲基化水平与年龄、性别无关。在CRC中,Duke C/D期患者Sitel位点的甲基化水平显著高于Duke A/B期患者(P<0.05)。而在GC中,组织学低分化和临床晚期肿瘤患者Site2位点的甲基化水平更高(P<0.05)。GC患者粪便潜血试验(OBT)的AUC为0.537,CRC患者粪便OBT的AUC为0.834。将粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合起来进行多参数回归ROC分析,GC和CRC的AUC可分别达到0.806和0.920。结论在所检测的2个hTERT启动子区域的CpG位点Site1和Site2中,GIC肿瘤组织的甲基化水平明显高于癌旁正常组织,GIC患者粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平明显高于非肿瘤患者。GIC患者粪便hTERT启动子特定位点的甲基化水平与肿瘤的分化程度、临床分期、以及侵袭性有关。粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合分析可以提高CRC患者诊断的敏感性和特异性。第二部分hTERT启动子突变在肾细胞癌中的研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,RCC包括不同类型的肿瘤,主要有透明细胞癌(clear cell RCC,ccRCC),肾乳头状癌(papillary RCC,pRCC)和肾嫌色细胞癌(chromophobe RCC,chRCC)。在RCC中,端粒酶活性异常升高,但是端粒酶活化的机制尚不明确。近来研究者在黑色素瘤中发现了hTERT启动子有2个高频突变：C228T和C250T,突变产成了新的ETS1结合序列,从而显著提高了hTERT启动子的转录活性以及hTERT mRNA的表达水平,并将端粒酶活性提高了2-4倍。因此,这种突变可能是造成hTERT表达和端粒酶活性在肿瘤中异常升高的原因之一。另外,hTERT启动子突变也和患者的临床病理特征或疾病的预后有关。研究显示,在黑色素瘤中,hTERT启动子突变与患者年龄、肿瘤的厚度、是否形成溃疡以及患者的预后等有关。在泌尿系统恶性肿瘤中,hTERT启动子突变在膀胱癌组织中的发生率较高,并且被认为是膀胱癌中目前已知的发生频率最高的基因改变。关于hTERT启动子突变是否存在于RCC中,现有的研究还不能明确这一点,并且也不清楚突变是否与患者的临床病理特征有关。目的分析RCC患者肿瘤组织中hTERT启动子突变的情况,明确以上突变与患者临床病理特征的关系,为进一步明确端粒酶异常活化的机制提供理论依据。方法本研究收集了109例RCC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,提取组织的DNA,然后采用Sanger测序法,分别检测hTERT启动子上C228T突变、C250T突变以及VHL基因改变的发生情况。提取肿瘤组织的RNA,采用定量Real-timePCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。统计分析肿瘤组织中hTERT启动子突变的发生与患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性以及VHL基因改变之间的相关性。结果在被检测的109例RCC肿瘤组织中,有10例存在hTERT启动子突变,其中9例是C228T突变,1例是C250T突变。在hTERT启动子突变阳性和突变阴性的肿瘤组织中,hTERT mRNA的表达水平明显不同,突变阳性的ccRCC中hTERT mRNA的表达水平明显升高。在96例ccRCC中,9例突变阳性的患者中处于临床Ⅲ/ⅣV期的有5例(5/9,55.6%),87例突变阴性的患者中处于临床Ⅲ/Ⅳ期的有9例(9/87,10.3%),呈现显著统计学差异(P=0.003)。hTERT启动子突变的发生率在患者年龄、性别、肿瘤大小等方面没有明显的组间差异。在9例检测出hTERT启动子突变的ccRCC患者中,有2例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭,而在未检测出突变的87例ccRCC患者中,4例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭。远处转移和肾被膜侵袭的发生率在突变阳性组和突变阴性组分别是5/9(55.6%)和7/87(8.0%)(P=0.001)。在所检测的77例ccRCC肿瘤组织VHL基因位点中,32例(41.6%)存在VHL位点的一个或多个改变,而在这些改变中,4例发生在hTERT启动子突变阳性的患者中,28例发生在hTERT启动子突变阴性的患者中,其差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论RCC肿瘤组织中存在着hTERT启动子突变。ccRCC中瘤组织中hTERT启动子突变与hTERT mRNA表达水平呈正相关,突变阳性组和突变阴性组在肿瘤的临床分期以及肿瘤的侵袭性方面存在明显差异,但是在患者的年龄、性别、肿瘤大小等方面无明显差异。ccRCC肿瘤组织中hTERT启动子突变阳性组和突变阴性组在VHL基因改变方面无统计学差异。第三部分精浆刺激宫颈癌端粒酶活化过程中hTERT的转录调控研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,宫颈癌的发生与多种因素有关,如人乳头瘤病毒(HPV)感染、频繁的性生活等,但其确切原因和发生机制尚不明确。研究证实,宫颈癌中hTERT的表达和端粒酶活性都异常升高。在宫颈组织由宫颈上皮内瘤变(CIN)向宫颈癌恶性转化的过程中端粒酶激活是非常重要的步骤,但是端粒酶活化的机制尚不明确。研究表明,hTERT的转录激活是端粒酶活化的关键步骤,但是目前hTERT的转录调控机制仍然不明确。hTERT转录活性的调控有很多因子的参与,包括转录活化因子和抑制因子。c-MYC、Sp1、雌激素等被证实是hTERT转录活化因子,能上调hTERT的表达；P53、转录激活蛋白1(AP-1)、Mad等被认为是抑制因子,抑制hTERT启动子的活性。精浆是精液的主要组成成分之一,含有前列腺素、雌激素、孕激素、血管生长因子、细胞因子、蛋白酶、蛋白激酶等多种物质。以往研究发现,精浆可以促进宫颈癌的发生和发展。精浆或前列腺素E2(PGE2)处理宫颈癌细胞系后,可以诱导PGE2受体EP1、EP4、表皮生长因子受体(EGFR)等表达上调,进而刺激肿瘤的发生发展。另有研究显示,精浆中的物质还可以刺激子宫内膜上皮细胞中白介素1-β(IL1-β).白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、环氧化酶-2(COX-2)等多种细胞因子或酶的表达,进而影响子宫内膜上皮细胞的功能。目的探讨在精浆刺激宫颈细胞恶变的过程中,hTERT的作用及hTERT的转录调控机制。方法(1)hTERT mRNA表达水平检测：三株宫颈癌细胞系HeLa Caski、SiHa,以及从人正常宫颈组织中分离出原代的宫颈上皮细胞,培养至对数生长期后经血清饥饿处理48h,实验组分别加入不同量的精浆,对照组均不加入精浆,24h后收获细胞,提取细胞总RNA后采用定量Real-time PCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。(2)端粒酶活性检测：经培养和处理的三株细胞系和宫颈上皮细胞(方法同上),收获细胞后采用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒定量检测端粒酶活性。(3)Western Blotting:检测COX-2、Spl的蛋白表达水平。(4)hTERT启动子活性测定：采用hTERT启动子活性报告质粒和Progema荧光素酶活性双报告系统进行检测。(5)siRNA技术：采用COX-2特异性siRNA,抑制HeLa细胞中COX-2的表达。(6)染色质免疫共沉淀(ChIP)技术：实验组HeLa细胞(加入PGE2或精浆)和对照组HeLa细胞(不加入PGE2或精浆),甲醛溶液使组蛋白或转录因子与DNA交联。收获细胞后将DNA超声碎裂成200-1 000bp的片段。用Spl抗体或乙酰化的组蛋白H3、H4抗体沉淀相应的DNA-蛋白质复合物,用蛋白A/G琼脂糖收集,然后洗脱、去交联。最后获取DNA,进行定量PCR扩增。(7)动物实验：雌性BALB/c裸鼠12只(出生6周)。血清饥饿的HeLa细胞,实验组加入精浆,对照组不加入精浆。悬浮后注射入裸鼠腋窝部皮下,3周后取出肿瘤组织分析。结果(1)在三株细胞系HeLa、Caski、SiHa中,实验组(精浆处理组)的hTERT mRNA的表达水平均明显高于对照组(P<0.01),实验组HeLa和Caski中端粒酶活性也明显升高(P<0.05和P<0.01)。而在原代培养的正常宫颈上皮细胞中,对照组hTERT mRNA表达量很低或无法检出,但实验组加入精浆(终浓度为1：10)时,hTERT mRNA的表达水平明显升高(P<0.05),端粒酶活性也明显升高(P<0.05)。(2)选用特异性COX-2 siRNA抑制HeLa细胞中COX-2的表达后,实验组(精浆处理组)的hTERT mRNA表达未见明显异常,而用非特异性siRNA处理HeLa细胞后,实验组hTERT mRNA表达水平明显高于对照组。(3)采用hTERT荧光素酶报告载体p181晰转染HeLa细胞,实验组HeLa细胞hTERT启动子活性明显高于对照组(P<0.05)。然后用COX-2特异性siRNA抑制COX-2表达后,实验组hTERT启动子活性与对照组相比,其差异不具有统计学意义。(4)采用Western Blotting的方法,实验组HeLa细胞分别加入精浆和PGE2,24小时后收集细胞进行检测,发现精浆处理组和PGE2处理组Spl蛋白的表达水平均明显升高,分别是之前的5.6倍和6.5倍。(5)染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现,HeLa细胞加入精浆或PGE2处理后,Spl抗体沉淀的DNA中hTERT启动子片段被明显募集,还同时伴有乙酰化的组蛋白H3和H4的增加。(6)动物实验结果显示,裸鼠体内精浆处理过的HeLa细胞所生长出的肿瘤组织比对照组HeLa细胞所生长出的肿瘤组织体积明显增大、重量明显增加。结论精浆能促进宫颈癌细胞系和原代培养的正常宫颈上皮细胞中hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性上调。精浆诱导HeLa细胞中hTERT启动子活性升高,同时伴有Spl表达增加以及Spl与hTERT启动子结合的增强。COX-2介导了精浆促进hTERT转录激活和端粒酶活性上调的过程,即这一过程是通过COX-2-PGE2-Sp1轴实现的。