防御素是人们在研究哺乳动物、昆虫等防御和抵抗病原微生物侵袭及感染过程中发现的一种内源性阳离子多肽，因其具有广谱抗菌作用以及不易产生耐药的特点而被寄厚望成为新一代抗生素。近年来越来越多的研究表明，除了具有抗菌活性，防御素还具有显著的抗病毒作用。此外，人们发现防御素作为天然免疫防线的重要成员，除可以直接杀伤、抑制病原微生物感染外，它还具有调节或激活免疫反应的作用，使其间接的协助机体抵抗病原微生物感染。人α防御素-5(human defensin-5，HD-5)主要由肠道Paneth细胞和女性生殖道粘膜上皮细胞表达和分泌，另外在尿道上皮组织中也检测到HD-5的存在。正是由于这些区域经常受到外来微生物的侵入，环境选择导致的进化压力造就了HD-5具有突出的抗病原微生物活性，因此更具开发应用价值。对于防御素的抗病毒作用，人们研究较多、较深入的是其抗包膜病毒如HIV、HSV等的作用，有关防御素对无包膜病毒的抗感染作用尚未引起人们的充分关注。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)作为通过性传播感染的常见的病原体，是一种典型的无包膜DNA病毒，约75%的人群在其一生中均会受到HPV感染；其主要侵害人生殖器、肛门以及口咽部位的上皮细胞。研究表明，高危型HPV的感染与一些肛门生殖器区肿瘤的发生之间有着一定关联，其中HPV16、HPV18亚型的长期感染已经被证实为宫颈癌发生的一个主要诱因。而目市面上还前没有针对HPV感染的特异性药物，因此深入研究HD-5的抗HPV作用，有望为防治HPV感染寻找新的治疗途径。由于HPV对宿主细胞有严格的特异性而且其增殖也依赖皮肤或黏膜细胞的分化，因此应用常规的组织培养技术不易进行大量制备；另外，从病变组织中分离获取足够数量的病毒用于抗病毒药物的药效评价也十分困难。随着HPV假病毒制备技术的发展，现在已经能够通过质粒转染，较简单地使目的HPV病毒体在外培养的细胞内进行增殖、表达和组装，并最终获得足够高滴度且包裹有荧光报告基因的HPV假病毒，从而便于病毒感染程度的直接观察和定量分析。另外，由于防御素分子内存在着3对二硫键，采用化学合成法对其制备存在着很大的技术难度，从而在一定程度上限制了其开发与推广应用。至于二硫键对防御素活性的影响，人们的认识并不一致，有些研究认为二硫键可以显著影响防御素的抗微生物活性；但也有研究认为防御素的抗微生物活性主要与其所带正电荷的多少有关，而与二硫键的存在与否关系不大。近来有文献报道，二硫键的缺失不会显著影响人β防御素3的抗菌活性，而去除了二硫键和半胱氨酸的防御素或其衍生多肽则比较容易通过化学合成法进行生产和制备。HD-5分子中的二硫键和半胱氨酸是否会影响其抗病毒活性，化学合成的HD-5线性多肽是否还具有抗病毒作用，这些都还缺乏深入研究。揭示二硫键及半胱氨酸在HD-5抗病毒活性中的作用，将会为其今后的研制与开发提供重要参考。本文利用HPV假病毒研究新技术首先制备了含绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)报告基因的HPV16假病毒，并建立HPV16假病毒感染宫颈癌细胞模型，然后采用荧光观察和流式细胞分析技术测定了几种不同构型HD-5多肽的抗HPV16感染作用，同时还观察了HD-5多肽的趋化作用。具体研究方法包括：通过将表达HPV16病毒衣壳蛋白的质粒与GFP报告基因质粒同时转染293FT细胞，制备包含GFP报告基因的HPV16假病毒并用多种方式进行鉴定，然后通过流式细胞分析测定GFP表达率来计算病毒滴度；用制备的HPV16假病毒感染3种不同宫颈癌细胞株，选定最合适的细胞感染模型；合成HD-5/N(天然构型)、HD-5/N-FAM(带荧光标记)、HD-5/Acm(线性合成，半胱氨酸被Acm修饰)、HD-5/Abu(线性合成，半胱氨酸被Abu替换)等HD-5多肽，首先采用激光共聚焦观察HD-5/N-FAM与细胞的作用情况，然后采用镜下荧光观察和流式细胞术检测在不同HD-5多肽作用48小时后，被HPV16假病毒感染的细胞中GFP蛋白的表达水平，并计算出多肽对病毒的抑制率；最后，分别用不同构型HD-5多肽刺激Caski细胞，ELISA法检测细胞上清中趋化因子IL-8的分泌情况，以观察HD-5多肽的间接趋化作用，同时，通过Transwell趋化迁移实验研究不同构型HD-5多肽对中性粒细胞的直接趋化作用。本文取得了以下主要研究结果：(1)表达HPV16病毒衣壳蛋白的质粒与GFP报告质粒均成功转染293FT细胞，经鉴定最终制备出含GFP报告基因的HPV16假病毒，滴度达到2.3×108TU/ml。(2) HPV-16假病毒能够感染体外培养的宫颈癌细胞，其中以C-33a细胞感染率最高。(3) HD-5/N能够剂量依赖性地抑制HPV16假病毒感染C-33a细胞，在浓度为50μg/ml时，HD-5/N对HPV16假病毒感染的抑制率已接近100%。(4) HD-5/N-FAM与细胞作用2~3小时后，共聚焦显微镜观察到HD-5可以大量进入细胞质，并且可能主要集中于内吞体、溶酶体中。(5)浓度为20μg/ml的HD-5/N、HD-5/Acm、HD-5/Abu对HPV16感染C-33a细胞的抑制率分别为96.48±5.67%、69.02±7.88%和2.71±1.53%。与HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV作用显著降低，而HD-5/Abu则基本失去抗HPV活性。(6)不同构型HD-5刺激Caski细胞分泌趋化因子IL-8的能力由高到低依次为：HD-5/N>HD-5/Acm>HD-5/Abu；同样，HD-5/N直接趋化外周血中性粒细胞迁移的能力也显著高于HD-5/Acm和HD-5/Abu。本文主要结论：(1)成功构建了含GFP报告基因的HPV16假病毒感染宫颈癌细胞模型，建立了基于流式细胞分析的抗HPV病毒感染定量检测方法，为准确评价HD-5的抗HPV病毒感染作用奠定了基础。(2) HD-5/N具有显著抑制HPV-16病毒感染的作用，并证实HD-5可以进入细胞质中，提示HD-5可能通过限制病毒颗粒在细胞内的转运、脱衣壳等过程来发挥抗病毒作用。(3)与HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV16作用明显减弱，提示二硫键对HD-5的抗病毒作用有着显著影响；与HD-5/Acm相比，HD-5/Abu的抗HPV16作用进一步减弱，提示HD-5多肽抗病毒作用的发挥依赖于分子中半胱氨酸残基的存在。(4) HD-5/Acm、HD-5/Abu的间接和直接趋化作用均较天然结构的HD-5明显减弱，提示HD-5的趋化作用可能受二级结构影响，HD-5介导的免疫趋化作用可能参与了其抗病毒效应的发挥。