目的：　　恶性肿瘤一直以来严重威胁着我们人类的身体健康，尤其近年来肿瘤发病率呈现逐渐增高趋势，而且发病群体越来越年轻化。为此，人们针对肿瘤发病机制与治疗做了很多研究。许多研究表明，肿瘤的发生是多种因素长期作用的结果，而不是一个简单的过程。其中，环境因素和遗传因素起重要调控作用。因此，研究肿瘤发生过程中内、外因素的作用机制是攻克肿瘤的重中之重。　　微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一类由小的、高度保守的约18-25个核苷酸组成的非编码RNA，参与转录后的基因沉默。不同于编码蛋白质的基因，miRNA可作用于靶基因的信使RNA中3非编码区，从而使其降解或者翻译抑制，达到调控基因表达的作用。所以说，微小RNA具有特异的基因调控功能。研究表明，一个单独的微小RNA可以干预多个不同靶基因的表达;同样，一个靶基因也可以同时受到多个微小RNA的影响。所以，人体1000多个miRNA基因组足以调节人类约1/3的蛋白质编码基因的表达，其广泛参与到细胞增殖、迁移、凋亡等极其重要的生物学过程中，从而在多种疾病发生、发展过程中发挥非常重要的作用，尤其在癌症、疼痛中。　　微小RNA(microRNA)在肿瘤发生中的作用是近年来关注的热点。研究证实人类肿瘤多伴随着致瘤miRNAs表达谱系的改变。癌症细胞中呈现miRNAs的表达改变，表现为抑癌miRNAs表达的下降/丢失以及致癌miRNAs表达的上调/增多的现象。这种改变必然导致机体中抑癌基因的缺失及致癌基因的聚集，从而引发恶性肿瘤。从既往研究可以证明，miR-100在前列腺癌中的表达是升高的，并且与前列腺癌的转移呈正相关，推断其发挥癌基因的作用;而miR-100在另一些肿瘤如肺癌、膀胱癌、宫颈癌中表达降低，推断其发挥抑癌基因的作用。本课题组前期研究，董伟等探讨了miR-100对人支气管上皮细胞(BEAS-2B Cell)行为学的影响，发现miR-100对BEAS-2B细胞的恶性转化起抑制作用。miR-100低表达或缺失能增强BEAS-2B细胞的增殖能力、非锚定生长能力、迁移能力，从而导致细胞恶性生物行为发生。　　砷是国际癌症研究中心(IARC)明确公布的具有致癌作用的化学物质，与多种癌症如皮肤癌、白血病、肺癌的发生、发展有着密切相关。既往研究发现，BEAS-2B细胞与低剂量的砷长期接触后，促进细胞恶性转化发生，与肺癌的高发有一定相关性。同时，人们对于砷致癌机制进行大量研究，也取得一定的成绩。　　肿瘤发生并非单一因素的结果，涉及多因素共同作用。外在的环境因素和内在的基因突变，两者在恶性肿瘤的最初形成和后期转移中扮演什么样的角色？又如何相互影响的？目前的作用机制并不明确。合作实验室一直研究这两方面因素与肿瘤发生的关系及其机制。我们发现miR-100表达的异常和砷暴露都与肺癌的发生、发展具有密切的相关性。那么，细胞发生基因突变是否会使机体对不良的环境因素更加敏感？于是我们设想人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)中miR-100低表达可能促进砷诱导的BEAS-2B细胞的恶性转化。　　为了验证这一假说，首先，我们需要构建抑制miR-100表达的BEAS-2B细胞株。然后，将其用低剂量As2O3慢性处理20代、40代。在此基础上，我们对经砷慢处理的miR-100表达正常/表达抑制BEAS-2B细胞进行相关的细胞行为学实验，以研究两者共同处理BEAS-2B细胞对其生物学行为的影响。结果显示miR-100低表达促进砷诱导的BEAS-2B细胞增殖，提高非锚定生长能力、迁移能力。随后，我们用裸鼠成瘤实验比较了各组细胞体内成瘤能力，结果表明miR-100低表达联合低剂量As2O3长期处理显著提高BEAS-2B细胞体内成瘤能力。这些结果证明抑制microRNA-100表达促进砷诱导的BEAS-2B恶性转化。最后，我们用Western blot检测初步探讨敲低miR-100的表达促进砷诱导的BEAS-2B细胞的恶性转化的机制可能与EMT有关。　　方法：　　1.慢病毒载体构建，包装miR-100抑制剂慢病毒，用其感染实验细胞。　　2.转染后的BEAS-2B细胞中miR-100表达水平用RT-PCR的方法检测。　　3.用As2O30.25μM处理BEAS-2B细胞，取0代、20代、40代细胞进行实验。　　4.用MTT实验、流式细胞术和平板克隆形成实验来检测As2O3长期处理和抑制miR-100表达对BEAS-2B细胞增殖能力的影响;经过处理的BEAS-2B细胞的非锚定生长能力用软琼脂集落形成实验测定;同时，处理后细胞的迁移和粘附能力用Transwell实验和粘附实验测定;　　5.为了观察转化细胞体内成瘤情况，取15只裸鼠，分三组完成成瘤实验，观察经砷处理的miR-100表达正常/低表达的BEAS-2B细胞体内成瘤能力。　　6.Western blot检测EMT相关蛋白，初步探讨敲低miR-100的表达促进砷诱导BEAS-2B细胞的恶性转化的可能机制。同时，用急性砷诱导实验作对比，比较急、慢性砷处理的对BEAS-2B细胞中EMT标志蛋白的影响。　　结果：　　1.实验得到100％感染率慢病毒重组BEAS-2B细胞株。经RT-PCR方法证实转染后的BEAS-2B中miR-100的表达水平明显降低。进而成功构建砷处理的miR-100低表达BEAS-2B细胞模型。　　2.MTT实验结果显示抑制BEAS-2B细胞中miR-100的表达，促进As2O3诱导的BEAS-2B细胞活力明显增加;平板克隆形成实验证实克隆形成能力也增强，尤其在As(40)代中变现最明显。　　3.用流式细胞仪检测细胞周期时发现，用低剂量As2O3慢性处理miR-100正常表达的BEAS-2B细胞组，导致处于S期的细胞比例增高，其中BEAS-2B(miR-NC)-As(40)组最高，S期所占比例55.20％;而在miR-100低表达细胞组中这种改变更明显，其中BEAS-2B(miR-100-inhibitor)-As(40)组S期所占比例高达62.47％。　　4.软琼脂集落形成实验结果显示同样受到低剂量As2O3慢性处理，与miR-100表达正常的BEAS-2B细胞组相比，抑制miR-100表达的BEAS-2B细胞组集落形成个数明显增加并且体积更大，非锚定生长能力明显提高。这提示低剂量As2O3慢性处理BEAS-2B细胞导致细胞非锚定生长能力增强，而miR-100的低表达更加促进砷诱导细胞非锚定生长能力增强。　　5.粘附试验和Transwell迁移实验结果表明，As2O3促进BEAS-2B细胞发生粘附和迁移，而抑制miR-100的表达后，As2O3诱导BEAS-2B细胞发生粘附和体外迁移的能力明显增强。　　6.裸鼠体内成瘤实验结果显示，与miR-100表达正常的细胞组比较，miR-100低表达BEAS-2B细胞组肿瘤生长更迅速。其中BEAS-2B(miR-100-inhibitor)-AS(40)细胞组肿瘤生长最快，表明miR-100低表达联合低剂量As2O3长期处理显著提高BEAS-2B细胞体内成瘤能力。　　7.Western Blotting结果表明砷处理使细胞中上皮样marker钙黏蛋白(E-cadherin)水平下降，其中抑制miR-100表达细胞组E-cadherin水平下降最显著;相反，间质样marker波形蛋白(Vimentin)、MMP-3和MMP-9等水平上升。同时，在砷急性处理的BEAS-2B(miR-100-inhibitor)细胞中，检测EMT相关蛋白得到类似结果，但没有慢性砷处理时明显。此结果提示机制与EMT有关。　　结论：　　1.抑制BEAS-2B细胞中miR-100的表达，能促进慢性砷处理所诱导的转化细胞增殖、非锚定生长及黏附迁移，从而加剧细胞行为学的恶性转化，增强裸鼠体内成瘤能力。　　2.抑制microRNA-100表达促进砷诱导的BEAS-2B恶性转化的机制与EMT相关。