氟络草酮(FLC)是一种吡咯烷酮类除草剂，化学名称为(3RS，4RS;3RS，4RS)-3-氯-4-氯甲基-1-（α，α，α-三氟间甲基）-2-吡咯烷酮。FLC在欧盟和北美国家中广泛应用，国内也已经引入该药，已在中国农药信息网（ICAMA）获得临时登记。文献公布的FLC毒性研究资料非常少，仅JOURNAL OFANDROLOGY在1986年发表的两篇会议文摘，指出FLC可引起雄性大鼠出现睾丸萎缩，精子数量和质量下降，血清卵泡刺激素(FSH)升高，生殖功能下降。2010年底，欧洲食品安全局(European FoodSafety Authority(EFSA))公布的FLC毒性评价报告指出，FLC具有可能的雄性生殖毒性，其毒作用靶器官是睾丸与附睾，主要表现为精子数量下降、异常增多，Sertoli细胞（支持细胞）空泡化。2011年3月，欧盟委员会健康与消费者保护总司在发布的报告中指出FLC是可能的环境内分泌干扰物。本课题的研究目的包括评价FLC对SD大鼠睾丸的影响、FLC诱导生精细胞凋亡及其可能机制探索和FLC对Sertoli细胞的损伤作用。通过建立SD雄性大鼠FLC暴露模型和Sertoli-生精细胞共培养、原代培养Sertoli细胞模型，评价FLC的睾丸毒性，探究其发生的主要通路机制，为FLC健康危险度评价提供基础资料，并为认识类似结构除草剂的生殖毒性提供借鉴。　　一、FLC对SD大鼠睾丸的影响　　40只SD雄性大鼠随机分为溶剂对照组和FLC低(30mg/kg bw/d)、中(150mg/kg bw/d)、高(750 mg/kg bw/d)剂量组，每组10只。SD大鼠经灌胃染毒，给药容剂为1mL/100g bw，每日一次，连续灌胃给药28天。染毒结束后，运用睾丸组织病理检查、曲细精管超微结构电镜观察、附睾尾精子计数和血清睾酮(T)水平等指标，评价FLC的睾丸毒性。应用试剂盒检测睾丸组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GSH-GR)和谷胱甘肽S转移酶(GSH-ST)水平。　　1.FLC影响睾丸组织氧化应激平衡。其中，中、高剂量组脂质过氧化标志物MDA含量明显增加，各剂量组GSH含量均明显下降，与对照比较，差异有统计学意义。抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px、GSH-GR和GSH-ST，均在FLC的影响下出现了不同程度的活力下降，其中高剂量组与对照组相比，以上抗氧化酶活力均出现有统计学意义的下降;中剂量组除GSH-GR外，其它的抗氧化酶均出现有统计学意义的活力下降;低剂量组只有CAT和SOD活力显著降低。　　2.FLC对SD大鼠睾丸毒性主要表现为，高剂量组大鼠睾丸质量、睾丸脏器系数、附睾质量、血清T水平和附睾尾精子计数与对照相比显著下降。睾丸组织病理检查:中、高剂量组大鼠睾丸出现不同程度的损伤，包括:1）间质水肿;2）曲细精管结构改变，萎缩;3）曲细精管生精上皮退化变性，生精细胞脱落至曲细精管管腔面;4）精母细胞、精子细胞死亡，管腔内出现多核巨细胞;5）部分曲细精管内的生精细胞耗竭;6）支持细胞空泡化;7)生精细胞细胞核损伤。曲细精管电镜观察显示生精细胞碎裂，精子细胞核仁、线粒体结构异常。睾丸质量，睾丸脏器系数、附睾质量、附睾尾精子计数、血清睾酮和睾丸组织病理学检查的基准剂量95％置信区间下限值(95％ BMDL)分别为:65.7、76.0、23、2.4、99.9和12.9mg/kg bw/d。因此，本研究中附睾尾精子计数和睾丸组织病理损伤是对FLC暴露较为敏感的指标。　　二、FLC诱导原代培养Sertoli-生精细胞凋亡及其可能信号通路机制　　选择出生后28-30天的雄性SD大鼠，采用两步酶消化法制备Sertoli-生精细胞原代共培养体系。设立0.1％二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组和3个FLC剂量组(10-8、1o-7和10-6 M)。实验结果显示:　　1.按以上剂量染毒6和24h后，开展四甲基偶氮唑盐(MTT)试验和生精细胞脱落计数，结果显示，相对溶剂对照组，染毒6h后，高剂量组细胞活力降至84.76±4.91(％)，染毒24 h后，各剂量组细胞活力分别降至72.16±2.53、50.62±4.13和44.30±12.66(％)。FLC染毒6、12、24和48 h后，各剂量组生精细胞脱落相对溶剂对照组，均显著增加，且呈剂量-反应关系和时间-剂量关系。　　2.FLC染毒24 h后，收集剂量组与溶剂对照组脱落的生精细胞和培养的贴壁细胞（包括贴壁培养的Sertoli细胞和黏附于其上的生精细胞），用annexinⅤ结合试验检测各组细胞凋亡情况。与各自的溶剂对照组相比，各剂量组脱落的生精细胞中，早期凋亡细胞百分比明显增高至24.25±2.88，33.08±2.43和29.23±2.54(％)，晚期凋亡/坏死细胞百分比明显增高至17.35±1.16，23.14±1.06和20.70±0.48(％)，差异有统计学意义。各剂量组共培养的Sertoli-生精细胞与对照组相比，早期凋亡细胞百分比显著增加至10.80±1.86，13.52±0.72和16.62±0.35(％)，差异有统计学意义，但晚期凋亡/坏死细胞百分比没有显著性改变。　　3.FLC染毒24、48和72h后，对Sertoli-生精细胞共培养体系中Fas/FasL、线粒体凋亡信号通路，以及核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路相关基因表达的影响。FLC染毒24 h使中剂量组半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)8基因表达水平明显升高;染毒24、48与72h后，高、中、低剂量组均使B淋巴细胞瘤基因-2(Bcl-2)表达水平不同程度显著下降，呈剂量-反应关系和时间-反应关系;FLC也上调了Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bel-2相关死亡启动子(Bad)、细胞色素c(Cytochrome c)、caspase9和caspase3基因的表达水平。FLC染毒72 h后，中、高剂量组NFκ B家族成员P50、 P65基因表达显著上调。而高剂量FLC染毒24 h即可使高剂量组p38 MAPK基因表达明显增加，染毒48和72h，各剂量组p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)基因表达都显著增加，FLC对p38 MAPK基因表达的影响呈剂量-反应和时间-反应关系。　　三、FLC对大鼠原代培养Sertoli细胞的毒作用　　选择出生后18-21天的雄性SD大鼠，采用两步酶消化制备Sertoli-生精细胞，细胞接种24h后，用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)低渗处理，纯化Sertoli细胞，建立Sertoli细胞原代培养体系。通过原代Sertoli细胞生长曲线，确定纯化后第2天开始对数生长期。设立0.1％ DMSO溶剂对照组和3个FLC剂量组(10-8、10-7和10-6M)。　　1.按以上剂量染毒6、12和24h后，开展MTT试验。染毒12h中、高剂量组原代培养Sertoli细胞增殖活力明显下降。染毒24 h各剂量组细胞增殖活力分别降至74.7±2.5、56.1±4.4和52.3±6.4(％)，呈剂量-反应关系。　　2.免疫荧光染色试验显示，FLC染毒6、12、24、48与72h，紧密连接(TJ)的重要组成蛋白封闭蛋白(Occludin)与闭锁小环蛋白-1(ZO-1)水平发生变化。染毒6h，中、高剂量组Occludin蛋白水平明显变化。染毒24和48h，各剂量组诱导Occludin水平更明显下降。高剂量染毒24h使Occludin基因表达显著下调。FLC处理原代培养Sertoli细胞12h，中、高剂量组ZO-1蛋白表达显著下调。染毒24和48h，各剂量组诱导ZO-1表达下降更为明显，呈剂量依赖性。染毒24、48与72h中、高剂量组ZO-1基因表达显著下调，ZO-1基因水平随着FLC浓度的增加而降低，呈剂量-反应关系。　　3.按以上剂量染毒6、12、24、48与72h，FLC对原代培养Sertoli细胞分泌功能相关基因表达有不同程度的影响。染毒24、48和72h，各剂量雄激素结合蛋白(ABP)基因表达随剂量增加而下调;染毒6、12和72h，高剂量组转铁蛋白Tf基因表达显著下调。FLC染毒24和48h抑制素B(INHB)基因表达随FLC浓度的增加而降低，呈现剂量-反应关系且各剂量组INHB基因表达与其相应的溶剂对照组相比有显著下调。染毒72h，只有高剂量组INHB基因表达明显下调。　　总结上述实验结果，FLC染毒28天可使SD雄性大鼠睾丸组织氧化应激水平升高、降低血清睾酮水平、睾丸曲细精管生精上皮退行性改变、Sertoli细胞空泡化，含吞噬小体的多核巨细胞增多，附睾尾精子计数下降。FLC可通过抑制Bcl-2和上调Bax和Bad基因表达，使Sertoli-生精细胞共培养体系内生精细胞发生凋亡。内源性凋亡信号通路可能是其主要的凋亡机制之一。同时NFκB和p38 MAPK信号通路也可能通过抑制抗凋亡基因Bcl-2和/或上调促凋亡蛋白基因Bax和Bad表达，参与调节FLC引起的Sertoli-生精细胞共培养体系中细胞凋亡。在原代培养Sertoli细胞中，FLC降低了TJs结构蛋白Occludin与ZO-1水平，影响BTB结构完整性;同时Sertoli细胞旁分泌的重要蛋白——ABP、Tf和INHB相关基因表达也在FLC影响下下调。说明FLC对Sertoli细胞存在毒作用。　　由此提出FLC睾丸毒性的可能机制是:　　1)诱导睾丸组织产生氧化应激，损伤睾丸组织结构的完整性，破坏生精过程需要的特定微环境;　　2)直接作用于生精细胞，通过内源性信号通路主导，NFκ B信号通路和p38MAPK信号通路协助，诱导生精细胞凋亡，破坏正常的生精过程;　　3)影响Sertoli细胞TJs结构蛋白表达，破坏BTB结构完整性;使Sertoli细胞旁分泌功能受损，无法维持曲细精管内生精细胞分化生长所需的高浓度睾酮和铁，干扰生精过程。