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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),又称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的接触性传染病,PRRSV主要引起怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和死亡。该病从美国首次发现以来,一直对世界各国养猪行业危害严重。2006年我国暴发的“猪高热综合征”(porcine high fever syndrome, PHFS)病原已被证实为变异的北美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),HP-PRRSV的显著特征是基因组非结构蛋白编码区Nsp2不连续缺失30个氨基酸。本研究室分离的HP-PRRSV TJ株经细胞克隆传代获得致弱毒株TJM。为研究PRRSV病毒复制和毒力增强的致病分子机制,我们克隆测序分析TJ株系列代次Nsp2基因的特性,利用真核表达和RNA干扰技术研究TJ株Nsp2蛋白在其复制中的作用效果,建立HP-PRRSV的反向遗传学技术操作平台,分别成功构建了HP-PRRSV TJ株和疫苗株TJM的感染性cDNA克隆。根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank号：EU860248),并结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,扩增HP-PRRSVTJ株噬斑克隆纯化前后的14个不同代次的Nsp2基因高变区片段及TJ株F3代和TJM(F92代)Nsp2全基因,并进行产物克隆测序和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明PRRSV TJ株在噬斑克隆传代过程中出现序列整段缺失,共120个氨基酸,并且从17代噬斑克隆后到122代一直稳定存在。TJM Nsp2缺失的高变区及Nsp2蛋白二级结构预测表明,缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生较大的变化,推测这可能与PRRSV TJM内毒力和致病力减弱有关系。6对强弱毒Nsp2蛋白序列比对结果表明TJ/TJM对间的序列差异更大,TJM疫苗株的返强几率就更低。为了探讨Nsp2蛋白的表达对PRRSV的增殖的具体影响,构建了表达PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2蛋白的真核质粒,携带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)基因表达盒,转染真核质粒,G418筛选,获得稳定表达PRRSVTJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞系。接种PRRSV后,病毒在Marc-145-TJ(Nsp2)和Marc-145-TJM细胞系上增殖更快,镜下观察感染细胞早期,PRRSV在表达Nsp2蛋白的细胞系上病变更大更明显,并且最终病毒的滴度高于对照。结果表明Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用。PRRSV在Marc-145-TJM(Nsp2)上的增殖系数比Marc-145-TJ(Nsp2)上小,推测120aa的缺失可能影响了Nsp2对病毒的调控作用。为研究Nsp2基因短干扰RNA对PRRSV复制的抑制作用,构建了针对PRRSV Nsp2的3个基因特异性shRNA表达载体,shRNA载体转染Marc-145细胞6h以后,用0.01MOI的PRRSV TJ株接毒,通过CPE、RT-PCR半定量和病毒滴度测定来检测病毒复制,结果表明,3个Nsp2的基因特异性siRNA都能够有效抑制PRRSV在Marc-145细胞内的复制和增殖,特别是在PRRSV复制早期。其中shRNA载体S-1和S-2处理细胞接毒后,病毒滴度TCID50降低明显,最多降低103.38,与空载体比较差异极显著(t检验P<0.001)。本实验根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分7段分别扩增了HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM全基因组cDNA。将扩增的每个病毒的各个cDNA重叠片段分别克隆到pCR-Blunt穿梭载体上。在基因组5’末端和3’末端Poly(A)尾后通过Overlap PCR技术引入HAM Rz和HDV Rz序列及酶切位点SnaB I及NotI酶切位点。将TJ株基因组第15143位C沉默突变为A和15148位C沉默突变为T,产生一个M1uI酶切位点作为鉴定拯救病毒的遗传标记。酶切、测序鉴定准确的各片段经5步亚克隆连接到pcDNA3.1真核表达载体上。将鉴定准确的含TJ株基因组全长cDNA的质粒和含TJM株基因组全长cDNA的质粒去内毒素纯化,转染Marc-145细胞,冻融物在Marc-145细胞上盲传,拯救出病毒。通过间接免疫荧光和遗传标记检测证明强弱毒重组病毒均拯救成功。比较强弱毒亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及生物学特性没有显著差异。以上结果表明HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株感染性克隆构建成功,为探讨PRRSV的分子生物学特性、致病机制和研制有效的标记疫苗奠定了基础。