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研究背景：神经病理性疼痛(Neuropathic Pain, NP)是临床常见但却缺乏有效治疗手段的症状和疾病,其发生、发展和维持的生物学机制及其治疗是一个具有挑战性的研究课题。NP发病机制目前尚不完全清楚,且缺乏有效的治疗措施,因此对NP及其相关的疼痛分子靶机理进行深入研究十分重要。众多研究表明,PKCγ在NP中枢敏化过程中起着非常重要的作用,是慢性疼痛基因治疗重要的分子靶,从而对PKCγ调控NP的确切机制值得深入研究。本研究拟从蛋白质组学结合RNA干扰技术探讨NP重要分子靶的作用机理,不仅有利于NP病理机制研究方法的完善,而且能为NP研究提供新的实验依据和思路。目的：为阐明PKCγ调控神经病理性疼痛的病理机制,本研究构建介导PKCγ基因shRNA重组慢病毒载体,体外转染原代培养的大鼠神经元,观察shRNA在体外对PKCγ表达的干扰效应。鞘内注射介导PKCγ基因shRNA的慢病毒载体于脊髓水平体内沉默PKCγ基因表达,并观察其对坐骨神经结扎(CCI)致神经病理性疼痛大鼠的镇痛效应。应用RNA干扰联合蛋白质组学技术高通量检测与PKCγ基因功能相关的蛋白质,筛选鉴定出PKCγ调控NP的特异蛋白,发现NP治疗新的靶点。方法：针对已筛选确定的PKCγ基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ(?)(?)EcoRI酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生重组慢病毒载体pGCSIL-shPKCy-GFP (LV-shPKCγ), PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,从而构建出介导PKCγ基因shRNA重组慢病毒载体。将LV-shPKCγ、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T包装细胞,包装后产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定慢病毒滴度。将慢病毒体外转染原代培养的大鼠神经元细胞,神经元细胞分为三组：Con组,未感染任何病毒的细胞组(Control); NC组,加阴性对照病毒感染的细胞组(Negative Control); RNAi组,加RNA干扰靶点病毒感染的细胞组(Knock Down),以Con组为对照,慢病毒转染神经元3天后,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。以Con组及NC组为对照,慢病毒感染神经元细胞5天后,Real-time PCR和Western blot检测(?)PKCγ基因mRNA和蛋白表达水平的干扰效率。成年雄性SD大鼠,体重260-320g,鞘内置管成功5天后,建立坐骨神经结扎(CCI)致神经病理性疼痛模型,随机分为以下4组：CCI+生理盐水(NS组,n=24)；CCI+pGCSIL-GFP空白载体组(LV-NC组,n=32)；CCI+pGCSIL-shPKCy-GFP载体组(LV-shPKCγ组,n=32)；假手术组+生理盐水(Sham组,n=24),Sham组仅暴露右侧坐骨神经分支,不结扎。CCI术后第5天,大鼠鞘内分别注射两种不同剂量NS, LV-NC或LV-shPKCγ各5μ1及10μ1。鞘内给药7天后各组各取16只大鼠断头处死,取L4-L5脊髓腰膨大处,Real-time PCR检测PKCy mRNA的表达,Western blot法检检测脊髓组织PKCy蛋白的表达。LV-NC组(?)(?)LV-shPKCγ组各取8只大鼠观察GFP脊髓转染效果。所有大鼠均测基础痛阈值,并在第3天、1、2、3、4、5、6周时测定大鼠右后爪机械痛阈值(PMWT)和热痛阈值(PWTL)。建立大鼠鞘内置管及坐骨神经结扎(CCI)致神经病理性疼痛动物模型,鞘内注射介导PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体LV-shPKCγ,脊髓水平稳定沉默CCI致神经病理性疼痛大鼠的PKCy基因表达,然后建立空白载体组(CCI+LV-NC, LV-NC组,n=8)和慢病毒载体介导RNA干扰组(CCI+LV-shPKCγ, LV-shPKCγ组,n=8)两组大鼠脊髓组织的蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)表达谱,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合生物信息学对两组大鼠脊髓腰段蛋白质表达谱的部分差异表达蛋白质点进行分析和鉴定,Western blot验证其部分差异表达的蛋白质。结果：PCR鉴定和测序证实,本研究成功构建了PKCy shRNA的重组慢病毒载体LV-shPKCγ。包装慢病毒后,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。慢病毒载体体外转染实验大鼠神经元致PKCγ基因的mRNA和蛋白表达水平均一致降低,与对照组比较,干扰组mRNA水平干扰效率达95%P<0.05),干扰组蛋白表达水平干扰效率达80%以上(P<0.05)。鞘内注射LV-shPKCγ7天后,与对照组比较,脊髓PKCγmRNA及蛋白质表达水平显著降低(P<0.05)；LV-NC组(?)(?)LV-shPKCγ组脊髓背角均可见大量GFP绿色荧光蛋白表达；与对照组比较,(?)LV-shPKCγ组PMWT(?)(?)PTWL较注射前明显延长,于第1周开始差异有统计学意义(P<0.05),镇痛效应可持续6周。LV-NC组(?)(?)LV-shPKCγ组大鼠腰段脊髓组织双向电泳图谱中各分离出清晰的约1050个蛋白质点,两组蛋白质斑点总体分布相似,2-DE图谱中分离出明显差异表达的36个蛋白质点,与LV-NC组比较LV-shPKCγ组有19个蛋白点表达显著上调,17个蛋白点表达显著下调。选取其中20个丰度较高、分辨清楚的差异蛋白质点进行MALDI-TOF MS质谱鉴定分析,共获得20个肽质量指纹图谱。利用Mascot查询软件搜索,共鉴定出18个差异表达蛋白质。生物信息学分析初步鉴定的蛋白质分类为：能量代谢酶类相关蛋白,抗氧化蛋白,分子伴侣、热休克蛋白,突触相关蛋白,细胞骨架蛋白等。涉及到细胞代谢、分子基因表达调控、突触传递等众多事件,Western blot验证了SNAP-25、TERA及AR三个部分差异表达的蛋白质,同蛋白质组学结果的表达变化水平相一致。结论：1.本研究成功构建了介导PKCy基因shRNA重组慢病毒载体(LV-shPKCγ)。2.本研究构建的重组慢病毒载体(LV-shPKCγ)能有效下调体外培养的大鼠神经元细胞PKCγ基因mRNA和蛋白的表达。3.鞘内注射不同剂量的LV-shPKCγ对神经病理性疼痛大鼠有显著持久的镇痛作用。4.联合应用RNA干扰和蛋白质组学技术筛选鉴定出18个PKCγ基因功能相关差异蛋白质,有助于阐明PKCγ调控神经病理性疼痛的分子机理,为发现慢性疼痛治疗新的靶点提供实验依据和线索。