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蛋氨酸是动物生长所必需的氨基酸之一,是必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸,是反刍动物和禽畜类动物生长所必需的的第一限制性氨基酸,是猪生长所必需的第二限制氨基酸。目前,蛋氨酸生产主要采用化学合成法,生物法生产蛋氨酸的技术还不成熟,所以建立先进的生物法蛋氨酸发酵和提取工艺,从而降低我国养殖业成本,是亟待解决的问题。本研究的目的,旨在利用代谢工程技术对微生物的代谢途径中关键步骤的限速酶进行改造,以增强终产物的形成和产率的提高。主要从以下两方面进行研究:一是大肠杆菌蛋氨酸代谢途径基因改造,二是蛋氨酸发酵条件的优化。大肠杆菌的蛋氨酸代谢途径中的一步关键反应是从高丝氨酸生成O-琥珀酰高丝氨酸,该反应由高丝氨酸琥珀酰基转移酶(metA,EC2.3.1.46)所催化,metA同时受产物蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的反馈抑制。本研究利用定点突变技术,分别得到两个大肠杆菌metA基因的突变体metA(Y299C)和metA(T24k),即:metA基因第896位碱基的A>G突变,引起氨基酸替代为Tyr→Cys;metA基因第71位碱基的C>A突变,引起氨基酸替代为Thr→Lys。首先,对两个突变体进行蛋白量检测,两个突变体和野生型相比蛋白量基本相同,证明突变对蛋白表达没有影响。其次,分别对两个突变体进行酶活性和抗反馈抑制能力检测,突变体metA(T24K)和野生型相比,酶活性和抗反馈抑制能力都有所下降;突变体metA(Y299C)和野生型相比,表现出了更高的酶活和更好的抗反馈抑制能力。最后,将获得的突变体metA(Y299C)转化到现有生产菌株中,在此基础上通过优化培养温度、菌龄和接种量三个发酵条件,蛋氨酸产量由原来的6.76g/L提高到10.35g/L。本研究成功获得大肠杆菌metA基因的突变体metA(Y299C),能有效提高宿主菌对终产物蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的抗反馈抑制能力,同时获得一株高产蛋氨酸菌株。