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目的建立胆囊癌CD133+细胞亚群的分离纯化方法，研究胆囊癌CD133+细胞亚群与CD133-细胞亚群的生物学特性。方法利用免疫磁珠法分选出CD133+细胞亚群，流式细胞仪检测CD133+细胞亚群所占百分比，免疫荧光法定位检测CD133蛋白表达，RT-PCR检测CD133mRNA表达，Western Blot检测CD133蛋白表达，单克隆形成实验观察单个CD133+细胞生长特性，裸鼠皮下移植瘤实验检测成瘤能力。CCK8法检测增殖能力及耐药特性，Transwell法检测侵袭能力，RT-PCR检测相关干细胞基因的表达。结果胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133+亚群所占相对百分比为(68.5±2.9)%、(0.3±0.2)%。GBC-SD细胞CD133mRNA相对灰度值(0.6466±0.0259)显著高于SGC996细胞(0.2181±0.0108, P=0.002)。CD133蛋白定位于细胞膜表面。GBC-SD细胞经免疫磁珠分选后，CD133+组CD133+亚群所占比例高达[(90.2±2)%]。CD133+组CD133mRNA表达(0.7734±0.0217)显著高于CD133-组(0.2146±0.0174,P=0.001)。 CD133+组CD133蛋白表达(0.3689±0.0375)显著高于CD133-组(0.0345±0.0040, P=0.003)。单克隆形成实验示单个CD133+细胞可形成新的细胞克隆，且CD133+组[(36.25±2.99)%]细胞克隆球形成率高于CD133-组[(4.5±1.29)%，P=0.006)]。裸鼠移植瘤实验提示CD133+组与未分选组移植成瘤率分别为100%和60%，而CD133-组不成瘤。CD133+组细胞增殖能力明显强于CD133-组(P=0.005)。经氟尿嘧啶(0.1μg/ml)和吉西他滨(1μg/ml)处理后，CD133+组抑制率均低于CD133-组(P=0.005, P<0.001)。Transwell法检测发现，CD133+组穿膜细胞数(23.78±8.74)显著高于CD133-组[(6.56±3.09), P=0.0007]。RT-PCR检测示CD133+组ABCG2、CD44mRNA相对灰度值[(0.8774±0.0191),(1.3681±0.0879)]显著高于CD133-组[(0.3276±0.0272), P=0.001],[(0.7891±0.0385), P=0.005]。结论免疫磁珠法可成功分离和纯化CD133+胆囊癌GBC-SD细胞，其具有较强的自我更新、致瘤潜能、增殖能力、耐药特性、侵袭能力，并表达部分干细胞相关标记物。