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目的:肿瘤细胞转移是乳腺癌患者死亡的最主要原因,涉及多个步骤包括肿瘤细胞迁移。本实验室近来研究发现,TBC1D3促进人乳腺癌细胞迁移,但TBC1D3诱导乳腺癌细胞迁移的机制依然未知。本研究拟用转录组高通量测序和免疫共沉淀结合质谱分析等等方法,分别筛选和鉴定TBC1D3的下游靶基因和细胞核内相互作用蛋白,阐明TBC1D3诱导乳腺癌细胞迁移的机制。方法:以Flag载体和Flag-TBC1D3分别转染MCF-7细胞,然后提取细胞总RNA,由广州锐博生物公司进行转录组高通量测序及分析,以筛选TBC1D3调控的潜在下游靶基因;用定量RT-PCR及Western blot等方法验证筛选的潜在下游靶基因包括乳腺癌细胞迁移相关的OLR1。用shRNA慢病毒载体,分别构建TBC1D3下游靶基因OLR1敲低的MCF-7和BT549细胞稳转株,用细胞划痕实验和transwell细胞迁移实验等方法,观察OLR1敲低对TBC1D3诱导人乳腺癌细胞迁移的影响,从而明确OLR1在TBC1D3诱导人乳腺癌细胞迁移中的作用。用TNFα抑制剂pomalidomide（Pom）下调OLR1表达,观察TNFα信号途径在TBC1D3诱导人乳腺癌细胞迁移中的作用;制备MCF-7和BT549细胞浆和细胞核蛋白,观察TBC1D3高表达对TNFα信号途径下游主要效应分子NF-κB活性的影响;用Pom抑制TNFα信号途径,观察该信号途径在TBC1D3调节NF-κB活性中的作用;用NF-κB抑制剂caffeic acid phenethyl ester（CAPE）抑制NF-κB活性,观察NF-κB在TBC1D3诱导OLR1表达和人乳腺癌细胞迁移中的作用,从而明确TNFα/NF-κB信号途径在TBC1D3诱导OLR1表达和人乳腺癌细胞迁移中的作用。用ELISA方法,观察TBC1D3高表达对MCF-7和BT549细胞TNFα分泌的影响;用Western blot方法,观察 TBC1D3 高表达对MCF-7 和 BT549 细胞 TNFα 受体（TNFR1 和 TNFR2）和该受体相关的多种衔接蛋白如TRAFs表达的影响;用蛋白降解分析及蛋白泛素化分析等方法,观察TBC1D3高表达对MCF-7细胞内TNFR1和多种TRAFs蛋白稳定性的影响及蛋白泛素化在其中的作用,从而从多方面探讨TBC1D3调节TNFα信号途径的机制。制备MCF-7细胞浆和细胞核蛋白,用免疫共沉淀结合质谱分析等方法,筛选TBC1D3的细胞核内相互作用蛋白;用免疫共沉定结合Western blot方法,对可能的相互作用蛋白进行初步鉴定,从而为深入探讨TBC1D3的细胞核内功能及其调节TNFR1和多种TRAFs在乳腺癌细胞内表达的机制奠定基础。结果:转录组高通量测序结果发现,在所检测到的37364个基因中,TBC1D3显著上调人MCF-7乳腺癌细胞43个基因,显著下调56个基因。定量RT-PCR（qRT-PCR）验证实验结果表明,TBC1D3上调或下调差异倍数最高的10个基因中,绝大多数基因包括乳腺癌细胞转移相关基因OLR1的两种方法（高通量测序和qRT-PCR）所得结果一致;Western blot实验进一步证明TBC1D3能促进MCF-7和BT549乳腺癌细胞OLR1蛋白表达,而敲低OLR1能显著抑制TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移,提示OLR1介导癌蛋白TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移。用TNFα抑制剂Pom抑制OLR1表达,也显著抑制TBC1D3诱导的MCF-7和BT549乳腺癌细胞迁移,提示TNF信号通路可能介导TBC1D3诱导的OLR1表达和人乳腺癌细胞迁移。与此一致,高表达TBC1D3能导致MCF-7和BT549细胞内NF-κB p65激活,而用Pom抑制TNF信号通路后,TBC1D3诱导NF-κB p65激活作用则丧失;而且,用NF-κB抑制剂CAPE也能抑制TBC1D3诱导的OLR1表达和MCF-7和BT549细胞迁移。这些结果表明TBC1D3诱导OLR1蛋白表达和乳腺癌细胞迁移至少部分依赖于TNFα/MF-κR信号途径的激活。有关TBC1D3激活TNFα信号途径的机制研究显示,TBC1D3高表达能刺激MCF-7和BT549乳腺癌细胞分泌TNFα,促进TNFR1、TRAF1、TRAF5和TRAF6的mRNA和蛋白表达,而TNFR2和TRAF3的表达无明显变化;TBC1D3高表达还能够抑制TNFR1蛋白的泛素化和降解,而对TRAF1、TRAF3、TRAF5和TRAF6蛋白稳定性无明显影响。总之,这些结果表明TBC1D3通过多种方式包括促进人乳腺癌细胞TNFα释放,增强TNFR1、TRAF1、TRAF5和TRAF6转录以及抑制TNFR1降解等激活TNF信号途径。用细胞核蛋白进行免疫共沉淀,发现两条TBC1D3的可能结合蛋白条带,分别在大约42kDa和66kDa,经蛋白质谱分析提示该两条差异蛋白条带分别匹配β-肌动蛋白和核纤层蛋白B。用免疫共沉淀结合Western blot方法随后进行验证,通过用抗Flag抗体进行免疫共沉淀,免疫沉淀复合物中可检测到与Flag-TBC1D3而不是Flag对照结合的核纤层蛋白B和β-肌动蛋白;用同种属IgG为阴性对照,用抗核纤层蛋白B或β-肌动蛋白分别进行免疫共沉淀,沉淀复合物中可检测到与核纤层蛋白B和β-肌动蛋白结合的TBC1D3。TBC1D3是否通过与β-肌动蛋白和核纤层蛋白B相互作用在细胞核内发挥其功能及调节TNFR1和多种TRAFs在乳腺癌细胞内表达有待进一步研究。结论:1.癌蛋白TBC1D3通过激活TNFα/NF-κB信号途径诱导OLR1表达和人乳腺癌细胞迁移;2.TBC1D3通过多种方式包括促进人乳腺癌细胞TNFα释放,增强TNFR1、TRAF1、TRAF5和TRAF6转录以及抑制TNFR1降解等激活TNF信号途径;3.TBC1D3与β-肌动蛋白在乳腺癌MCF-7细胞浆和细胞核内均可能相存在相互作用;4.TBC1D3与核纤层蛋白B在乳腺癌MCF-7细胞核内可能存在相互作用。