氮量子点对人结肠癌Caco-2细胞的毒性评价研究

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目的:探讨氮量子点(Nitrogen-rich quantum dots,N-dots)在体外人结肠癌Caco-2细胞中的毒性作用及机制,为N-dots在生物医学领域的应用中奠定基础,同时也为N-dots的相关实验研究提供理论依据。  方法:1.使用Perkin Elmer UV-Vis-NIR(Lambda900)分光光度计、Cary Eclipse荧光光谱仪、EM-2100透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)和Zeta sizer3000HS型激光动态光散射粒径分析仪对N-dots的荧光量子产率、形状、粒径大小和分散性的信息进行分析。2.以人结肠癌Caco-2细胞为研究对象,用0、50、100和200μg/mL浓度的N-dots处理细胞,处理6h、24h和72h,应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖情况,随后选择24h和0、50、100和200μg/mL作为后续研究的实验时间及浓度梯度。3.运用流式细胞术检测细胞的凋亡情况、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平、线粒体膜电位变化(mitochondrial transmembrane potential,MTP)与溶酶体膜透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP)的情况。使用激光共聚焦显微镜(Laser scanning Confocal Microscopy,LSCM)观察MTP变化的情况。4.应用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法检测胞中蛋白质羰基化的表达水平。5.免疫印迹法(Western blot)检测暴露N-dots后细胞中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9(caspase3、caspase9)和细胞色素c(Cytochrome c)的表达水平。运用SPSS20.0软件进行统计学分析。  结果:N-dots是一种直径约为1.85nm,最大吸收峰在340nm处,最大发射峰在460nm左右的结晶椭圆形量子点。在不同浓度(0-200μg/mL)和不同时间(6h、24h和72h)的N-dots处理Caco-2细胞后,发现在6h时,N-dots对细胞的抑制作用不显著,24h之后随作用时间的增加,对细胞增殖的抑制作用显著增强,抑制率呈剂量-时间效应关系。浓度为0、50、100和200μg/mL的N-dots处理Caco-2细胞24h后早期和晚期的细胞凋亡率以浓度依赖性方式呈线性增长,与作用前比较差异有统计学意义(P<0.01)。在浓度为0、50、100和200μg/mL的N-dots处理Caco-2时,细胞内MTP下降和ROS水平升高,并且在200μg/mL浓度N-dots处理下Caco-2细胞中蛋白质羰基化水平显著升高,与作用前比较差异有统计学意义(P<0.05)。N-dots导致细胞内溶酶体膜透化,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。N-dots使细胞中的caspase9和Cleaved-caspase3蛋白表达明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。浓度为100和200μg/mL的N-dots处理Caco-2细胞,导致细胞中Cytochrome c蛋白的表达显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。  结论:本研究的数据表明N-dots作用Caco-2细胞后产生明显的毒性,N-dots能够引起Caco-2细胞凋亡,发生机制可能和胞内ROS水平增加、线粒体介导的凋亡通路激活有关。
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