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绞股蓝属植物是目前除人参属外唯一含有人参皂苷的植物,其中绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)系葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物,素有“南方人参”的美誉,其有效成分——绞股蓝皂苷(主要为人参二醇型皂苷)具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、提高免疫力等多种功效。近年来,人参皂苷生物合成途径已获得深入解析,但关于绞股蓝皂苷的合成途径研究仍十分匮乏。绞股蓝皂苷生物合成途径研究对于揭示达玛烷型皂苷生物合成途径在不同植物中的演化机制具有重要科学意义,并将进一步推动基于合成生物学的达玛烷型皂苷的工业化生产研究。为了获得与绞股蓝皂苷合成相关的基因序列,本研究对绞股蓝不同组织器官(根、茎、叶)进行三代 PacBio RSII测序和二代 Illumina NextSeq500 测序。PacBio数据经ICE聚类和Quiver矫正去冗余后,共获得66,046条polished consensus sequences;Illumina 数据经 Trinity 拼接,获得 140,601 条 trinityunigenes。两部分数据合并去冗余后,最终得到140,157条final unigenes,平均长度为750 bp。Final unigenes通过功能注释和分类,得到5个氧化鲨烯环化酶基因(OSC),145个细胞色素P450基因(CYP450),254个UDP-糖基转移酶基因(UGT)和1362个转录因子(TF),这些基因被用于进一步筛选参与绞股蓝皂苷生物合成和调控的基因。基于系统进化分析,具有相同或相似催化功能的基因在进化树上通常聚为一支。因此在本研究中,将这几类基因分别与已鉴定的参与人参皂苷生物合成途径的基因构建进化树,挑选出属于同一家族或同一进化分支的基因。其中GpOSC1和GpOSC4分别与β-香树脂合成酶和葫芦二烯醇合成酶属于同一进化分支;GpCYP716A1和GpCYP716A2与人参中已鉴定的2个P450s聚为一支,分类到CYP716家族;13个GpUGT与人参的6个UGT分别聚为一支,分类到 UGT71、UGT74和UGT94家族;13 个 GpWRKY 与 PqWRKY1 皆属于IIc subgroup;4 个 GpbHLH 与 PnbHLH1均分类到IVasubgroup。由于同一代谢途径的基因通常是共表达的,因此共表达分析被用于进一步缩小候选基因的范围。本研究以上游途径已鉴定基因做参考,利用实时荧光定量PCR技术,对上述筛选出的基因在不同器官和MeJA处理前后的基因表达情况进行研究,发现GpOSC1、GpCYP716A2和GpUGT35与上游基因呈现相似的基因表达模式,即在根、茎和叶中的表达量依次升高,且可受MeJA诱导,在18 h表达量达到最高,因此我们推测这三个基因是参与绞股蓝皂苷生物合成的主要候选基因。此外,根据共表达分析结果,我们推测6个GpWRKY和GpbHLH68可能参与绞股蓝皂苷生物合成的调控。将筛选出的候选基因GpOSC1、GpOSC4和GpCYP716A2构建到表达载体pYES2-URA或pESC-URA上,在酿酒酵母中进行异源表达,经半乳糖诱导后、提取产物进行GC-MS检测,发现GpOSC1催化产物在30.68 min(产物1)出现特异峰,GpOSC4催化产物在13.21 min(产物2)出现特异峰,分别与标准品Dammarenediol-Ⅱ和Cucurbitadienol保留时间和质谱图结果一致,此结果说明GpOSC1编码达玛烯二醇合成酶,GpOSC4编码葫芦二烯醇合成酶。GpCYP716A2经酵母表达后发现具有未知功能,有待进一步研究。本研究构建了GpOSC1的过表达和RNAi的绞股蓝毛状根体系,拟通过检测基因过表达或RNAi抑制表达后毛状根皂苷含量的变化来进一步验证GpOSC1在原植物体中的功能。蛋白质的结构通常决定着蛋白质的功能。本研究以1W6J(人羊毛甾醇合成酶)为模板,使用Modeller 9.18分别对GpOSC1和PgDS Ⅱ进行同源建模和底物2,3-氧化鲨烯分子对接后发现,底物主要通过疏水作用、范德华力进入靶蛋白活性位点。与PgDSⅡ蛋白相比,GpOSC1蛋白与底物的结合能更低,说明GpOSC1蛋白与底物结合更稳定。根据同源建模和分子对接预测GpOSC1蛋白的活性位点,结合定点突变技术,设计了 7个氨基酸位点突变体以对GpOSC1进行定向改造。酵母表达产物经GC-MS检测后发现,D485N、S412F和W418A突变使GpOSC1催化底物产生达玛烯二醇的功能完全丧失,C486A、C564A、H479A和Y259H突变造成达玛烯二醇含量不同程度的降低。本研究通过转录组测序结合基因家族的进化分析和共表达分析,筛选出参与绞股蓝皂苷生物合成与调控的候选基因,并通过酿酒酵母异源表达,成功对GpOSC1、GpOSC4进行了功能鉴定,进而利用同源建模和定点突变技术首次对达玛烯二醇合成酶结构与功能的相关性进行了探索。绞股蓝皂苷的生物合成途径解析为绞股蓝皂苷的合成生物学研究提供了有用的元器件,也为通过定向改造提高酶活性提供了有力的理论支撑。