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目的:肝移植术是治疗终末期肝病的有效方法,但器官冷保存期间的冷缺血损伤是导致移植肝脏功能衰竭或早期无功能的主要原因。细胞凋亡在肝脏冷缺血再灌注损伤中起重要作用,最近研究表明肝窦内皮细胞(SECs)较肝实质细胞对冷缺血再灌注损伤更敏感。蛋白转导结构域(PTDs)是一小段可以直接透过细胞膜的多肽,蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内发挥生物功能。HIV-1反式激活蛋白(TAT)是目前研究较多的PTDs之一。TAT可将与其相连的蛋白转导入肝、肾、心肌以及脑等器官组织。血红素氧合酶-1(HO-1)是机体血红素分解代谢的限速酶,具有抗凋亡,抗氧化、抗炎症等作用。已有研究证实,TAT与HO-1的融合蛋白(TAT-HO-1)可以成功转导进入胰腺βTC-3细胞,并可显著提高细胞活力。是否能利用TAT将HO-1转导入肝细胞,用以减轻肝脏冷保存期间肝细胞的损伤尚有待进一步探讨。本研究通过观察大鼠肝脏冷保存期间肝组织HO-1含量、保存液中谷丙转氨酶(ALT)水平、肝组织内皮素(ET)和透明质酸(HA)水平、肝实质细胞和SECs凋亡以及凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达水平的变化,探讨TAT-HO-1是否可以在冷保存期间转导进入肝脏并发挥保护作用,为实现临床应用蛋白转导技术减轻供肝冷保存期损伤奠定基础。方法:将HO-1 cDNA编码区与合成的TAT-PTD片断连接到原核表达载体pET32a上。构建TAT-HO-1-pET32a质粒,经测序鉴定后,转化E.coli BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导表达、Ni-NTA-agarose纯化,Western blot法对TAT-HO-1进行定性分析,化学法检测TAT-HO-1活性,证实所得蛋白为有活性的TAT-HO-1融合蛋白后进行动物实验。选择雄性SD大鼠48只,体重250～300g。根据所用保存液的不同按照随机数字表分为两组(n=24):C组,肝脏应用4℃HTK液进行灌注和冷保存;P组,肝脏应用4℃含TAT-HO-1 50μg/ml的HTK液进行灌注和冷保存。参照Kamada等的方法切取肝脏。取下肝脏置于相应保存液40ml中4℃保存。各组分别于冷保存0h、6h、12h和18h随机选取6个肝脏,抽取保存液置于4℃冰箱保存,切取肝组织标本立即置于-80℃冰箱保存,应用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量,分析TAT-HO-1转导进入肝脏的情况,全自动生化分析仪测定保存液中谷丙转氨酶(ALT)水平,放射免疫分析法检测肝脏组织ET和HA含量。原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法分别检测肝实质细胞和SECs凋亡,同时采用免疫组化染色法测定凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果:1免疫组化染色结果显示两组冷保存6h、12h、18h时肝实质细胞和SECs中均可见明显棕黄色HO-1阳性染色分布,P组各时点肝组织中HO-1含量均高于C组(P<0.05)。2两组保存液中ALT水平随保存时间延长而升高(P<0.05),冷保存6h,12h和18h时保存液中ALT水平均低于C组(P<0.05)。两组肝组织ET和HA含量随保存时间延长而升高(P<0.05),冷保存6h,12h和18h时肝组织中ET和HA含量,P组均低于C组(P<0.05)。3肝实质细胞和SECs凋亡率均随保存时间延长而升高(P<0.05)。冷保存6h,12h和18h时,肝实质细胞和SECs凋亡率P组均低于C组(P<0.05)。4两组Bcl-2、Bax均有表达,冷保存6h,12h和18h时,P组Bcl-2表达高于C组(P<0.05),而Bax低于C组(P<0.05)。结论:TAT-HO-1可以在冷保存期间转导进入大鼠肝脏并减轻肝实质细胞和SECs凋亡,对冷保存期间的肝脏功能发挥保护作用,其机制可能与TAT-HO-1增加肝组织Bcl-2表达,减少Bax表达有关;蛋白转导技术将成为减轻肝移植冷保存期损伤的新措施。