荧蒽降解菌株的分离鉴定及其基因组学研究

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荧葸是四环的高分子量多环芳烃(High-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons,HMW-PAHs)化合物,是存在于石油污染土壤中的主要PAHs类物质,其潜在的强致癌性、致突变性及致畸性,对人类健康造成了严重威胁。由于荧蒽本身具有较强的疏水性,因此很难通过传统的物理化学方法进行彻底降解。而利用微生物降解法消除污染环境中的荧葸等HMW-PAHs化合物,是一种高效、环保、经济的方法。本实验采用富集培养方法,从多环芳烃污染的土壤中分离筛选到一株能以荧蒽为唯一碳源和能源生长且生长状况最佳的菌株DN002,通过形态观察、生理生化指标、16SrRNA同源序列比对及系统进化发育分析,鉴定该菌株为木糖氧化产碱菌(Achromobacter xylosoxidans),其最适生长温度为32℃,最适生长pH范围是7-7.5。该菌株对荧蒽有较强的降解能力,在14天内对500mg/L初始浓度的荧葸降解率为92.8%。通过检测荧葸降解途径中的关键酶的活性,发现菌株DN002中水杨酸羟化酶的活性较高,其次是吲哚双加氧酶;水杨酸羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶在荧葸诱导48h后,活性有显著提高。在此基础上,从全基因组水平系统筛选DN002菌株荧蒽降解相关基因,共构建了含有18000多个克隆的随机转座突变体库,并从中筛选到了16株不能以荧蒽为单一能源和碳源生长的转座突变体;通过随机PCR实验,定位了13个发生突变的基因;尤其是hisA、hisDl、leuCl、purD及AXYL00207基因的转座突变体,基本生长与野生型相比没有明显变化,但是对荧蒽降解的中间产物水杨酸和龙胆酸的利用能力降低,暗示这些基因可能是与荧葸降解直接相关的基因。与此同时,本实验利用SDS-PAGE和2-DE方法检测了菌株DN002在荧葸诱导下细胞全蛋白的表达变化,并对差异极其显著的蛋白点进行了分离和鉴定,成功确定了8个蛋白质点的氨基酸序列,其中诱导后新表达的蛋白有5个,分别是细胞外溶质结合蛋白(extracellular solute-binding protein)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-丙氨酸结合蛋白2(leucine-,isoleucine-,valine-,threonine-,and alanine-binding protein2,LIVTA-BP2)、甘油-3-磷酸ABC超家族ATP结合盒式转运体(glycerol-3-phosphate ABC superfamily ATP binding cassette transporter)以及二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶(dihydrolipoamide succinyltransfer-ase)。诱导后表达量显著提高的蛋白有3个,包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和类铁蛋白结构域结合蛋白2(ferritin-like domain-containing protein2)等;利用鉴定出的蛋白同源序列设计简并引物,成功在菌株DN002中扩增出了2个蛋白的编码基因,序列比对结果显示,分别与Achromobacter xylosoxidans A8中的亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-丙氨酸结合蛋白2(LIVTA-BP2)和类铁蛋白结构域结合蛋白(ferritin-like domain-containing protein)的编码基因有94%和88%的同源性。进一步验证了在DN002菌株中确实存在这两个跟荧葸降解密切相关的同源基因,它们的编码蛋白在荧葸降解过程中起着非常重要的作用。同时也为进一步阐明该菌株的荧蒽降解代谢机理提供了研究基础。
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