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目的:敷和备化方是全国名老中医荣远明教授治疗肝癌(Hepatocellular Carcinoma HCC)的验方,治疗HCC临床效果良好。本研究旨在通过分离、培养CD133+Hep G2肝癌干细胞,用敷和备化方含药血清培养,检测肝癌干细胞表面标记物CD133的表达水平,以及肝癌干细胞分化相关指标转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA表达和蛋白水平。从而验证敷和备化方可通过调控肝癌干细胞表面标记物CD133以及转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达从而起到诱导肝癌干细胞分化的作用,为中医药防治肝癌提供理论和实验依据。方法:1.CD133+Hep G2肝癌干细胞的分离与鉴定:通过免疫磁珠法分选出CD133+Hep G2肝癌干细胞,采用流式细胞术鉴定CD133+Hep G2肝癌干细胞阳性比率达到90%以上,作为后续实验的细胞。2.分别用2%、4%、8%、10%、12%、16%六个不同浓度敷和备化方含药血清干预CD133+Hep G2肝癌干细胞,通过CCK-8法测定细胞抑制率,筛选出最佳含药血清浓度。将细胞分为阳性对照组、敷和备化方组、血清对照组、空白对照组。阳性对照组用0.5%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)干预,敷和备化方组用敷和备化方含药血清干预,血清对照组用正常大鼠血清干预。3.采用流式细胞术检测CD133+Hep G2肝癌干细胞百分比。4.Q-PCR法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA水平。5.Western Blot法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的蛋白水平。结果:1.CD133+Hep G2肝癌干细胞的分离与鉴定:培养Hep G2肝癌细胞,通过免疫磁珠法分选出CD133+Hep G2肝癌干细胞,流式细胞术鉴定CD133+Hep G2细胞阳性率达到99.6%,细胞结构完整,生长情况良好,可用于后续试验。2.CCK-8法筛选最佳含药血清浓度:敷和备化方含药血清对CD133+Hep G2细胞的增殖有抑制作用,且和时间、浓度相关,16%敷和备化方含药血清干预72小时抑制作用最明显。后续试验中中药组采用16%敷和备化方含药血清。3.流式细胞术检测敷和备化方含药血清干预后CD133+Hep G2细胞百分比:血清对照组CD133+Hep G2细胞阳性率94.1%;空白对照组94.9%;DMSO组90.8%;敷和备化方组84.2%。敷和备化方组和DMSO组都可降低CD133+Hep G2细胞百分比(P<0.05),且敷和备化方组作用更明显(P<0.05)。4.Q-PCR法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA水平:与空白对照组相比,敷和备化方组和DMSO组都可下调转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达(P<0.05),且敷和备化方组作用更明显(P<0.05)。5.Western Blot法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的蛋白水平:与空白对照组相比,敷和备化方组和DMSO组都可下调转录因子SOX2,NANOG和OCT4蛋白水平(P<0.05),且DMSO组对SOX2蛋白水平作用更明显(P<0.05)。敷和备化方组对NANOG和OCT4的蛋白水平作用更明显(P<0.05)。结论:1.敷和备化方含药血清能有效降低肝癌干细胞表面标记物CD133的表达水平。2.具有健脾调肝功效的验方敷和备化方能降低肿瘤干细胞分化相关转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达水平,诱导肝癌干细胞分化。