大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应halI/halR基因表达及其抑制剂的研究

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研究表明,致腐微生物的腐败特性表达与群体感应(Quorum sensing,QS)系统密切相关,然而目前研究大多集中在腐败菌QS系统的表型,而对QS调控基因的研究相对较少。本文主要以腐败大菱鲆中分离得到的一株蜂房哈夫尼亚菌为研究对象,利用分子生物学技术筛选获得该菌的QS调控基因halI/halR,利用分子对接及荧光定量PCR技术探究不同环境因素对其表达情况的影响,并探究该菌对外源信号分子的感受能力;其次,本文使用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026作为生物传感器菌株,探究香兰素对该菌QS系统的腐败表型,并利用荧光定量PCR技术和分子对接技术分析香兰素对蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)QS系统的作用机制;最后,将QS抑制剂香兰素应用于冷藏大菱鲆鱼片中,验证其保鲜效果。本文旨在深层次探究腐败微生物的QS机制,及QS抑制剂香兰素的作用机制,为建立靶向控制腐败微生物QS为基础的水产品保鲜技术提供理论依据。主要结论如下:1.通过对蜂房哈夫尼亚菌进行16S rRNA鉴定,并利用BLAST方法筛选并验证蜂房哈夫尼亚菌QS的调控基因halI/halR。2.利用荧光定量PCR技术检测不同环境因素对蜂房哈夫尼亚菌QS调控基因halI/halR表达情况的影响,以16S rRNA为内参基因,通过??Ct计算得出不同碳源培养时,halI基因的表达量从大到小依次为:木糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖;halR基因表达量从大到小依次为:木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖,可见,木糖的添加可显著上调halI和halR基因的表达;其次,当两个基因处于碱性条件时(pH>7),会抑制其表达;而低温条件(15℃)下两个基因表达量明显上升,当超过其最适温度(28℃)后表达量有所下降。此外,当环境中存在外源信号分子时,荧光定量结果表明,该菌可利用外源环境中存在的信号分子,且外源信号分子的添加显著上调halR基因的表达,其中C6-HSL最显著,且通过分子对接结果推测,AHLs与受体蛋白HalR间结合能力越强,则越会刺激halR基因的表达。3.以紫色杆菌CV026为生物传感器菌株,检测出香兰素具有抑制活性,并进一步探究不同浓度香兰素对蜂房哈夫尼亚菌QS腐败表型及相关基因的抑制机理。结果表明:亚抑菌浓度香兰素可显著降低CV026紫色菌素产量,当其浓度为1 mg/mL时,紫色菌素的产量降低了58.95%,且该菌C6-HSL和C8-HSL的产量仅有0.535和0.874μg/mL;通过光学显微镜和扫描电镜观察可知,香兰素处理后,生物膜膜状物减少,膜结构变得稀疏,且随着其浓度增加,生物膜表面出现裂痕。最后,利用荧光定量和分子对接技术从基因角度探究香兰素对蜂房哈夫尼亚菌QS的作用机制,荧光定量结果表明:香兰素可同时显著抑制halI和halR基因的表达,且呈浓度依赖;最后通过分子对接分析香兰素和天然配体C6-HSL与信号分子受体蛋白HalR的相互作用可得知,香兰素、C6-HSL与受体蛋白之间均形成两个氢键作用力和疏水相互作用,同时存在一个共同的氢键作用力,因此推测香兰素与天然配体C6-HSL存在竞争结合机制。4.将QS抑制剂香兰素应用于冷藏大菱鲆鱼片保鲜中,通过对菌落总数、TVB-N、pH和风味物质的测定验证其保鲜效果,结果表明香兰素处理组与空白组之间的菌落总数差异不显著,但却显著降低了TVB-N值,且pH的波动范围较小,这表明香兰素作为群体感应抑制剂可延长大菱鲆鱼片货架期2-3 d。
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