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本文应用病毒常规分离方法、RT-PCR方法与实时定量PCR方法对来自广东、广西和云南的47份疑似鸭肝炎病毒感染的病料进行了鉴定,观察了DHV-I/GD/QD/2000株的病毒形态,并比较了三种病毒纯化方法;定性和定量分析了DHV-I/GD/QD/2000株在雏鸭体内的动态分布;并对感染了病毒的雏鸭肝功能动态变化进行了研究。
1.制备了三株已被鉴定的鸭肝炎病毒Ⅰ型(AV-211、DHV-I/GD/F 和 DHV-I/GD/QD/2000)的抗血清(免疫效价分别是:AV-211≤1:20LD<,50>;DHV-I/GD/F≤1:40LD<,50>;DHV-I/GD/QD/2000≤1:160LD<,50>)。用这三种血清鉴定来自广东、广西与云南等地区的47份病料,证实47份病料都感染了鸭肝炎病毒Ⅰ型。
检测三种血清对47个分离株感染的雏鸭的保护效果表明:DHV-I/GD/F 株血清和DHV-I/GD/QD/2000株血清对广东地区的病毒免疫效果明显高于对广西和云南两地的免疫效果。AV-211株血清对广西和云南两地的病毒免疫效果稍好。提示三个地区的病毒有抗原性差异。
以含DHV-I/GD/QD/2000株的肝组织为被检材料比较了离子捕获技术、超速离心技术和 ViraPrep Mammal Kit三种病毒的纯化方法。结果表明:三种纯化方法都纯化出了病毒粒子。ViraPreprU Mammal Kit纯化效果最佳,获得了高纯度的病毒粒子;电镜下的病毒粒子呈圆形或近圆形,大小介于20~40nm之间。与离子捕获技术和超速离心技术相比较,ViraPrepTM Mammal Kit具有操作简单、快速等特点。
2.根据已公布的鸭肝炎病毒Ⅰ型基因组序列,设计了一对引物,建立了鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT-PCR鉴定方法。结果表明:所用引物对Ⅰ型鸭疫里墨氏杆菌、番鸭细小病毒、新城疫野毒株、鸭瘟弱毒株、鸡法氏囊野毒株以及健康鸭肝脏等的RNA扩增均为阴性,对47株新病毒的病料RNA进行扩增,全部阳性;对DHV-I/GD/QD/2000株的RNA最小敏感度为50.3pg。随机对8个扩增结果测序证实:8条序列与DHV-I/GD/QD/2000的片段高度相似。
3.在病毒基因组的RNA聚合酶区域筛选了一段序列,建立了鸭肝炎病毒Ⅰ型的实时定量PCR 鉴定技术。鸭肝炎病毒Ⅰ型绝对定量的标准曲线为:Y=-3.061X+38.91,相关系数是1。检验证实此方法只对鸭肝炎病毒Ⅰ型特异,最小敏感度为2.41个分子拷贝数。
根据已公布的鸭3.磷酸.甘油醛脱氢酶(GAPDH)的基因序列,建立了鸭GAPDH基因的实时定量PCR技术,绝对定量的标准曲线为:Y=-3.274X+37.457,相关系数0.9973。
4.用病毒分离方法观察病毒在体内的分布的结果表明:在接种后12h内,原病料接种的雏鸭有少数死亡。用没有死亡的雏鸭组织制匀浆回归雏鸭,除看肝脏有不同程度的肿大或出血外,肉眼无法看到其他组织病变。在原病料接种后1d时,雏鸭死亡达到最高峰。用死亡雏鸭组织匀浆重复接种雏鸭,可以引起典型的Ⅰ型鸭肝炎病症状。1d~4d收集的组织病料中都有病毒存在。其中,不同时间的粪便样品,处理后接种雏鸭,部分时间的病料可以致雏鸭死亡,这种结果可能提示存在康复鸭带毒。
用RT-PCR方法观察病毒在体内的分布的结果表明:接种后4h,可以在肝脏、肾脏和血液检测到病毒;接种后8h,在脾脏、心脏和肺脏也能检测到病毒。在24h后所有检测样本都可以检测到病毒的存在。病毒在心脏与肺脏中存在的时间在五天内,而在肝脏中能持续一周时间。在血液中从4h首次检测开始到试验结束,一直可以检测到病毒。粪便从24h检测到病毒存在后,一直到试验结束时,都能检测到病毒的存在。
通过测定不同时间的病毒与GAPDH的分子拷贝数,定量分析了病毒在雏鸭体内的分布。结果表明:肝脏、肾脏、脾脏和血液在接种后4h即可检测到病毒存在,然后是心脏和肺脏。病毒在心脏与肺脏中存在的时间比在肝脏中存在的时间短。而在血液中从4h首次检测开始到试验结束,一直可以检测到病毒。粪便从12h即可检测到病毒,一直到试验结束时,都能检测到病毒的存在。结果提示人工感染病毒在4h内就可以在机体的一些组织中繁殖;另外在感染过鸭肝炎病毒的康复鸭群中可能存在隐性带毒的鸭子。
5.检测了不同时间的雏鸭血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、γ谷氨酰转肽酶(γ-GT)、丙二醛(MDA)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)等物质的含量变化。结果表明:在疾病早期,SOD与ALB含量显著降低(P<0.05或P<0.01),MDA、ALT、γ-GT、TBIL 显著上升(P<0.05或P<0.01),提示有急性肝炎发生;TP 轻微下降,GLB则变化不明显。在疾病中期,TP表现显著下降(P<0.05或P<0.01),其他指标继续原来的状态。疾病后期,雏鸭开始康复,各指标开始向正常值变化,此时GLB出现升高,TP急剧上升。结果提示抗体正在产生。