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本研究希望了解抑制Frizzled-2基因是否对缺氧/复氧大鼠肝细胞有保护作用并进一步探讨其可能的机制。第一部分实验研究目的:探讨Frizzled-2基因在缺氧/复氧(H/R)BRL-3A细胞中的表达情况,并观察对Frizzled-2基因表达进行抑制后缺氧/复氧BRL-3A细胞的凋亡情况变化。材料和方法:将BRL-3A细胞分为H/R组、质粒H/R组(NC-H/R组)、沉默Frizzled-2基因H/R组(Si-H/R组)、正常细胞组(Cell组),进行H/R造模后,检测Frizzled-2及其配体蛋白Wnt5a基因和蛋白的表达,并检测处理过的各组细胞的凋亡情况。结果:H/R组BRL-3A细胞的Frizzled-2和Wnt5a基因及蛋白均较Cell组明显上调(p<0.05),细胞的Caspase-3蛋白表达较Cell组均上升(p<0.05);而沉默Frizzled-2基因后,Frizzled-2基因及蛋白明显下调(p<0.05),Wnt5a配体蛋白则仍明显上调(p<0.05);Si-H/R组细胞的LDH检测和Caspase-3蛋白表达均较H/R组下降(p<0.05),流式细胞检测细胞早期凋亡率明显减少(p<0.05)。结论:沉默Frizzled-2基因能够减少BRL-3A细胞的损伤和凋亡。第二部分实验研究目的:探讨抑制Frizzled-2基因表达对H/R处理后BRL-3A细胞的Ca2+超载的影响。材料和方法:同前分组,通过荧光检测各组细胞内Ca2+浓度的变化。结果:H/R造模处理能促进H/R组细胞内Ca2+浓度上升,而Si-H/R组较H/R组细胞的Ca2+浓度明显下降(p<0.05)。结论:沉默Frizzled-2基因能够减轻缺氧/复氧BRL-3A细胞内Ca2+浓度的超载。第三部分实验研究目的:探讨抑制Frizzled-2基因表达对H/R处理后BRL-3A细胞自噬功能的影响。材料和方法:同前分组,进行H/R造模后,检测各组Beclin-1蛋白和Atg7蛋白,及LC3BII和I蛋白的比例,电镜观察细胞内自噬体形成的情况。结果:H/R组细胞Beclin-1蛋白和Atg7蛋白明显上调(p<0.05),但LC3BII和I蛋白的比例明显下降(p<0.05),电镜显示Si-H/R组自噬体和自噬溶酶体明显增多。结论:抑制Frizzled-2基因表达能够促进缺氧/复氧BRL-3A细胞的自噬功能。第四部分实验研究目的:探讨排除缺氧/复氧的干扰后,抑制Frizzled-2蛋白表达对正常BRL-3A细胞内Ca2+浓度及自噬相关蛋白的影响,确认其作用。材料及方法:将BRL-3A细胞分为正常细胞组(Cell组)、空质粒组(NC组)、Frizzled-2基因沉默组(Si组)、Frizzled-2基因过表达组(FRI组),以前述方法分别检测各组Frizzled-2和Wnt5a基因和蛋白表达情况,Ca2+浓度、自噬情况;结果:Si组细胞内Ca2+浓度的下降(p<0.05),Beclin-1蛋白和Atg7蛋白减少(p<0.05),LC3BII/I上升(p<0.001),Caspase-3蛋白降低(p<0.001);电镜中自噬小体增加;FRI组表现相反。结论:沉默Frizzled-2基因对正常BRL-3A细胞仍然具有降低Ca2+浓度促进自噬的作用。