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血管内皮功能紊乱是多种心血管疾病致病机制的起始及核心环节,是急性心肌梗死,动脉粥样硬化等心血管疾病的致病基础。研究表明,糖尿病、动脉粥样硬化、心肌缺血等心血管疾病的患者循环血液中MVs水平上升,这些MVs中包含内皮细胞在受到刺激或凋亡时所释放的EMVs。EMVs并非简单的生物学标志物,它们同时在血管内皮功能紊乱的致病机制中发挥着重要作用。不同病理状态下产生的EMVs具有不同的生物学功能。I/R作为多种心血管疾病的病理生理基础,可引起血管内皮功能紊乱及凋亡坏死。但有关H/R诱导产生的H/R-EMVs是否在血管内皮功能紊乱中发挥作用以及H/R-EMVs是否可以削弱离体大鼠胸主动脉环的内皮依赖性舒张反应尚不清晰。因此,本实验拟通过H/R诱导HUVECs产生EMVs,探讨H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环舒张功能的影响。目的:研究H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环舒张功能的影响及其相关机制。方法:1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立用含10%FBS的DMEM培养基培养HUVECs 24 h达到融合70-80%后,弃去培养上清液,换用缺氧液。将HUVECs放置于缺氧装置中,使用95%N2-5%CO2混合气,流速20 L/min,充气15 min以排出缺氧装置中的空气。将HUVECs细胞在缺氧装置中缺氧培养12 h,继而复氧培养4 h。通过MTT法检测细胞存活率,建立H/R诱导HUVECs损伤的模型。2.H/R-EMVs的获取、流式鉴定及定量检测采取梯度离心的方法从细胞H/R的培养上清液中收集H/R-EMVs,应用1μm标准微球和PE-CD144抗体标记,流式细胞仪对H/R-EMVs进行鉴定;采用2μm标准微球对H/R-EMVs进行计数;BCA法对H/R-EMVs进行蛋白定量。3.离体大鼠胸主动脉环的制备选取Wistar雄性大鼠,体重250±10 g左右,颈脱臼处死,开胸,获取胸主动脉。将胸主动脉放入盛有4℃K-H液的培养皿中,用眼科剪小心去除包住胸主动脉的筋膜,将动脉剪成3-4 mm的胸主动脉环。4.不同浓度H/R-EMVs处理离体大鼠胸主动脉环用含10%FBS的DMEM培养基培养离体大鼠胸主动脉环。实验分为正常对照组(Control),H/R-EMVs 2.5,5,10,20μg/m L组,共5组。H/R-EMVs 2.5,5,10,20μg/m L组分别加入2.5,5,10,20μg/m L的H/R-EMVs,Control组加入等体积的D-Hank’s液,孵育4 h。5.不同浓度ACh,SNP介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率的测定将离体大鼠胸主动脉环连接到离体组织灌流装置,调整预负荷为2 g。使用PE 10-6 mol/L预收缩离体大鼠胸主动脉环使其收缩达最大值。15 min后,分别使用10-9-10-6 mol/L的ACh及SNP测定离体大鼠胸主动脉环舒张率。6.离体大鼠胸主动脉环中NO含量的测定采用Griess Reagent法,测量离体大鼠胸主动脉环中NO的含量。7.离体大鼠胸主动脉环中p-e NOS/t-e NOS的测定Western blot法检测离体大鼠胸主动脉环中p-eNOS/t-eNOS的表达。8.离体大鼠胸主动脉环中SOD,MDA含量的测定SOD,MDA试剂盒测定离体大鼠胸主动脉环中SOD,MDA的含量。结果:1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立在缺氧12 h复氧4 h处理后,HUVECs出现皱缩和变形,部分细胞悬浮在培养液中。与Control比较,MTT检测细胞存活率显著降低(73.73%±2.61%vs100%±0%,P<0.05),其降低程度适中,实验结果稳定,适宜采用该模型诱导HUVECs损伤。2.H/R-EMVs的获取、流式鉴定及定量检测低温超速离心后,可以观察到超速离心管底部有肉眼可见的较小面积的白色沉淀,即为H/R-EMVs。流式检测证实诱导得到粒径<1μm且CD144+的微粒,计数结果为23017±322/μL。H/R-EMVs蛋白浓度为0.35±0.10μg/μL。3.H/R-EMVs对ACh及SNP介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率的影响与Control组(93.59%±7.53%)比,H/R-EMVs 5,10,20组由ACh介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率(81.11%±6.12%,67.71%±5.96%,43.50%±9.35%,P<0.05或P<0.01)显著降低。H/R-EMVs在浓度范围为5-20μg/m L时剂量依赖性的降低了ACh介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率;与Control组比,H/R-EMVs 2.5组由ACh介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率(99.53%±2.47%)无统计学差异。SNP介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率在各组之间无统计学差异。4.H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环中NO含量的影响与Control组(84.64±4.37μmol)相比,H/R-EMVs 5,10,20μg/m L组NO含量(72.61±0.81,34.58±1.97,21.45±1.16μmol,P<0.01)显著降低。H/R-EMVs在浓度范围为5-20μg/m L时剂量依赖性的降低了离体大鼠胸主动脉环中NO的含量。与Control组相比,H/R-EMVs 2.5组NO含量(88.26±4.68μmol)无统计学差异。5.H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环中p-eNOS/t-eNOS表达的影响Western blot结果显示,与Control组相比,随H/R-EMVs浓度增加,H/R-EMVs5,10μg/m L和H/R-EMVs 20μg/m L组p-e NOS蛋白表达减少,t-e NOS蛋白表达不变,p-e NOS/t-e NOS比值下降。H/R-EMVs在浓度范围为5-20μg/m L时,剂量依赖性的降低了离体大鼠胸主动脉环中p-e NOS的含量。与Control组相比,H/R-EMVs 2.5μg/m L组离体大鼠胸主动脉环p-e NOS蛋白表达无统计学差异。6.H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环中SOD活性及MDA含量的影响与Control组相比(SOD:52.22±1.25 U/mg prot;MDA:1.91±0.11μmol/mg prot),H/R-EMVs 5,10和H/R-EMVs 20μg/m L组离体大鼠胸主动脉环SOD活性下降(23.44±0.99,17.28±0.63,10.88±0.54 U/mg prot,P<0.01),MDA含量上升(3.27±0.19,8.08±0.19,10.22±0.17μmol/mg prot,P<0.01)。H/R-EMVs在浓度范围为5-20μg/m L时,剂量依赖性的降低了离体大鼠胸主动脉环中SOD的活性并提高了MDA的含量。与Control组比,H/R-EMVs 2.5μg/m L组离体大鼠胸主动脉环SOD活性(51.48±2.12 U/mg prot)及MDA含量(1.97±0.13μmol/mg prot)无统计学差异。结论:1.本实验成功建立了缺氧12 h复氧4 h诱导HUVECs损伤的模型。2.采用缺氧12 h复氧4 h的方法诱导HUVECs产生H/R-EMVs,流式检测证实诱导得到粒径<1μm且CD144+的H/R-EMVs,其蛋白浓度为0.35±0.1μg/μL。3.H/R-EMVs的剂量在5-20μg/m L范围内时,剂量依赖性的削弱了离体大鼠胸主动脉环的舒张率。4.H/R-EMVs的剂量在5-20μg/m L范围内时,剂量依赖性的降低了离体大鼠胸主动脉环的NO含量,NO含量降低导致离体大鼠胸主动脉环舒张率的下降。5.H/R-EMVs的剂量在5-20μg/m L范围内时,剂量依赖性的降低了p-e NOS蛋白的表达,对t-e NOS的表达无影响。提示H/R-EMVs可能通过下调p-e NOS的表达从而减少NO的产生。6.H/R-EMVs诱导了OS反应的发生,H/R-EMVs的剂量在5-20μg/m L范围内时,剂量依赖性的使离体大鼠胸主动脉环SOD活性下降,MDA含量增加。提示H/R-EMVs削弱离体大鼠胸主动脉环舒张率,其机制可能包括诱导OS反应的发生。