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研究背景:肺动脉高压（Pulmonary hypertension,PH）是一种包括多种疾病的综合征,长期的肺组织缺氧状态,肺血管收缩和肺动脉的血管重构,肺血管阻力的进行性升高和肺动脉压（Pulmonary arterial pressure,PAP）升高,导致肺动脉壁变厚、肺动脉管腔变窄和右心室后负荷增加的血流动力学改变,这是PH共同的病理生理学变化机制。如果不尽早诊断、尽早治疗,很快会导致右心功能衰竭甚至死亡。尽管现有的治疗手段可以提高PH患者的生存质量,但所有可用的疗法仍仅用于姑息治疗,仍缺乏行之有效的防治手段,因此,如何能提供新的分子诊断及靶向治疗的靶点,依然是需要探索且持续研究的课题。沉默信息调节因子1（Sirtuin1,SIRT1）是一种Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶,在脉管系统中表达丰富,调节细胞增殖、迁移和凋亡等各种细胞生物学事件。环状RNA（Circular RNA,CircRNA）具有多种生物学功能,参与了肺和心血管等疾病的发病机制。Circ-Sirt1是由亲本基因SIRT1基因的2-7外显子形成的circRNA分子,SIRT1能够抑制肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）的增殖,而circ-Sirt1对PASMCs的影响却尚不清楚。转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smads 信号通路是 TGF-β1所介导的一系列信号传递过程,TGF-β1、Smad3及Smad7已被证明在血管重塑中起作用。Circ-Sirt1在PH中的作用尚不清楚,circ-Sirt1是否与TGF-β1/Smad3/Smad7相关联也未见报道,因此我们进行了以下研究:研究目的:探索circ-Sirt1/SIRT1通过TGF-β1/Smad3/Smad7抑制低氧诱导肺动脉高压模型中PASMCs增殖、迁移的机制。研究方法:1.动物模型初步检测:探索 circ-Sirt1、SIRT1 和 TGF-β1/Smad3/Smad7 在慢性低氧PH大鼠肺动脉组织中的表达情况。构建慢性低氧PH大鼠模型,右心导管术测量右心室收缩压（Right ventricle systolic pressure,RVSP）,称量计算右心室肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）,HE 及免疫荧光染色肺组织切片。应用RT-qPCR和Western blot检测大鼠肺动脉组织中circ-Sirt1的 mRNA 及 SIRT1 的 mRNA、蛋白水平,并检测 TGF-β1、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白水平。2.细胞水平机制研究:探索circ-Sirt1/SIRT1在调控低氧rPASMCs增殖和迁移中的作用及机制。2.1取常氧下的大鼠肺动脉组织,刮除内膜和外膜,剪成碎块状,用组织贴壁法培养原代rPASMCs,并用α-SMA免疫荧光实验鉴定。2.2细胞功能实验:构建过表达circ-Sirt1的质粒转染rPASMCs,低氧培养后,通过RT-qPCR和Western blot测定各组rPASMCs的circ-Sirt1的mRNA及SIRT的mRNA、蛋白水平的变化,并检测TGF-β1/Smad3/Smad7通路分子及α-SMA、VCAM-1的mRNA及蛋白水平表达变化;应用流式细胞术、CCK-8法、划痕实验检测rPASMCs的细胞周期、增殖活力、迁移能力的变化;用免疫荧光实验检测α-SMA、VCAM-1的荧光变化。2.3细胞回复实验:构建小干扰RNA si-SIRT1,过表达circ-Sirt1质粒转染rPASMCs后,再用si-SIRT1转染。低氧培养后,检测rPASMCs的SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad7、α-SMA、VCAM-1 的 mRNA 及蛋白水平的变化;检测rPASMCs的细胞周期、增殖活力、迁移能力的变化;并用免疫荧光检测α-SMA、VCAM-1的荧光变化。3.动物模型治疗研究:探索circ-Sirt1腺病毒载体在慢性低氧PH大鼠模型中的治疗作用。构建高表达circ-Sirt1的腺病毒载体,注入大鼠尾静脉,慢性低氧诱导大鼠40天后,测算大鼠RVSP、RVHI;RT-qPCR、Western blot检测大鼠肺动脉组织circ-Sirt1、SIRT1的表达水平,检测TGF-β1/Smad3/Smad7通路分子及 rPASMCs 增殖相关的 VCAM-1、α-SMA、ICAM-1、PCNA、vimentin 的表达水平;HE和α-SMA、ICAM-1、PCNA、vimentin免疫荧光染色肺组织切片。研究结果:1.慢性低氧诱导的PH大鼠的RVSP和RVHI升高,肺动脉血管重构明显。在低氧PH大鼠模型肺动脉组织中的circ-Sirt1和SIRT1表达水平显著低于常氧组,而Smad3、Smad7、TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平升高。2.1成功分离并培养了常氧的原代rPASMCs。2.2过表达circ-Sirt1质粒转染后,低氧rPASMCs中circ-Sirt1和SIRT1的表达升高,rPASMCs的细胞周期、增殖活力和迁移能力受到抑制,伴随TGF-β1、Smad3、Smad7 通路分子及 rPASMCs 的标记物 VCAM-1、α-SMA的表达水平降低,同时rPASMCs中的α-SMA、VCAM-1免疫荧光减少。2.3回复组rPASMCs中SIRT1的表达降低,rPASMCs的增殖活力和迁移能力增强,伴随TGF-β1、Smad3、Smad7通路分子及VCAM-1、α-SMA的表达升高,同时rPASMCs中的α-SMA、VCAM-1免疫荧光增多。Si-SIRT1有效逆转了过表达circ-Sirt1对rPASMCs增殖活力、迁移能力及TGF-β1/Smad3/Smad7通路的抑制作用。3.Circ-Sirt1腺病毒组大鼠的RVSP、RVHI较对照组明显降低;circ-Sirt1腺病毒组大鼠肺组织动脉组织中circ-Sirt1、SIRT1表达升高,TGF-β1、Smad3、Smad7 表达下降,VCAM-1、α-SMA、ICAM-1、PCNA、vimentin 的表达也是下降的;circ-Sirt1腺病毒组大鼠肺动脉组织的免疫荧光减少。研究结论:1.Circ-Sirt1、SIRT1 以及 TGF-β1/Smad3/Smad7 信号通路和 PH 有密切相关性,可能参与其发病机制。2.Circ-Sirt1能够抑制低氧rPASMCs的增殖活力和迁移能力,而这一作用可能是circ-Sirt1 正向调节SIRT1 的表达,进而抑制TGF-β1/Smad3/Smad7 通路来实现的。3.高表达circ-Sirt1可明显减轻低氧诱导大鼠的RVSP、RVH及肺小动脉重构。高表达circ-Sirt1抑制了低氧诱导大鼠的肺动脉组织中TGF-β1、Smad3、Smad7通路的表达。