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产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株具有多重抗逆特性的工业二倍体酵母,是优良的底盘细胞。但C.glycerinogenes的二倍体基因组、无有性生殖、缺乏选择标记等限制了该菌的基因编辑效率。新一代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统因为其快速、高效和简便的优点,可轻松实现基因点突变、片段敲除或敲入等精确编辑,被广泛应用于动物、植物和微生物。本论文旨在将CRISPR-Cas9技术应用于C.glycerinogenes的基因编辑,并进行了技术优化和TRP1、URA3、ADE2等基因的编辑应用,有以下主要研究成果:（1）为构建CRISPR-Cas9系统,设计和组装了可以插入Cas9、sgRNA等CRISPR组件的酵母整合表达载体pMY;通过Western Blotting分析不同密码子优化的Cas9基因的表达情况,确定适用于C.glycerinogenes的CgCas9序列;通过靶向反筛基因TRP1敲除试验,比较了ScSNR52p、GDPp、GAPp三种不同的启动子在C.glycerinogenes中转录sgRNA的强度,结果表明只有GAP启动子配合HH和HDV核糖酶序列转录sgRNA可实现TRP1基因的敲除,选择性筛选效率可达100%。（2）为解决上述系统中存在的载体构建困难、整合效率低等问题,以CgCas9和sgRNA瞬时表达转录元件代替CgCas9-sgRNA整合表达载体,通过靶向TRP1基因敲除进行试验,同样可实现效率为100%的基因敲除,据此获得一种构建更简易的CRISPR-Cas9瞬时表达系统;对C.glycerinogenes 5S rRNA启动子进行了鉴定,通过对其介导下的TRP1基因突变频率(3.6×10-6)分析,结果表明采用5S rRNA启动子取代GAP启动子用于sgRNA的转录,可进一步获得一种免克隆操作的sgRNA瞬时转录元件快速构建方法;同时,考察了修复模板30 bp至1000 bp不同长度同源臂对TRP1基因突变频率的影响,并结合修复模板构建难易程度的分析,确认长度为50 bp的同源臂是修复模板构建的最佳选择,可简化修复模板的构建。（3）对优化后的瞬时CRISPR-Cas9系统在基因编辑应用上进行了评估,具体为:同时靶向TRP1和URA3基因,实现了双基因的一次性敲除(筛选效率为100%,突变频率为8.7×10-7);通过TRP1筛选标记的循环再利用,实现了ADE2和TRP1基因的先后连续敲除（筛选效率分别为80%和100%）;通过在TRP1基因敲除的修复模板中加入绿色荧光蛋白基因gfp序列,实现了外源基因gfp的敲入（筛选效率为100%）和表达;通过在TRP1基因位点编辑表达木糖脱氢酶基因xylB（筛选效率为100%）,获得了木糖酸生产菌株,采用溶氧策略两步法发酵,可从含70 g·L-1葡萄糖和24 g·L-1木糖的模拟木质纤维素水解液中得到28.4 g·L-1乙醇和9.1 g·L-1木糖酸。这些结果表明,本研究构建的CRISPR-Cas9系统在C.glycerinogenes基因编辑上具有良好的实际应用效果。