目的:长期过量饮酒可导致酒精性肝病的发生,使细胞外基质和胶原蛋白过度沉积,进而发展成肝纤维化甚至肝硬化。肝纤维化是临床多发病和常见病,目前现代医学缺乏较为理想的治疗药物。因此,开发研究安全有效的肝纤维化候选药物已成为当前国内外研究的热点,可为抗肝纤维化药物提供基础数据和理论支撑。本研究采用酒精(EtOH)和硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化小鼠模型,从体内和体外两个层面研究刺五加酸(AA)以及葫芦素E(CuE)的抗肝纤维化作用及潜在机制。方法:(1)酒精诱导的慢性酒精模型中,C57BL/6小鼠36只,随机分成六组:正常组、EtOH 组、EtOH+AA-20 组、EtOH+AA-40 组、AA-40 组和 pair-fed 组。AA组小鼠通过灌胃的方式给药20和40 mg/kg,连续灌胃28天。除正常组和AA单独给药组外,给予EtOH组、EtOH+AA-20组和EtOH+AA-40组饮食含5%酒精的Lieber-DeCarli饲料28天,而pair-fed组是喂食不含酒精的液体对照饲料。9h后,乙醚麻醉小鼠,颈动脉取血,肝组织固定在10%的福尔马林中或保存于-80℃冰箱。采用苏木精-伊红染色法(H&E)、油红染色法、尼罗红染色法检测组织病理学变化。免疫组织化学染色以及组织荧光染色检测固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)和F4/80的表达情况。结合蛋白印迹与PCR检测肝纤维化相关标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ),并测定炎症相关因子以及AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)上下游基因的表达情况。对人肝星状细胞LX-2给予AMPKα特异性siRNA转染48 h,然后给予12.5 μM刺五加酸继续培养2h。沉默AMPKα后利用蛋白印迹,PCR以及免疫荧光法检测AMPK和脂肪代谢相关沉默信息调节因子(SIRT1)的表达变化以及白细胞介素-1受体相关激酶4,即IRAK4蛋白表达情况。给予LX-2细胞12.5 μM的刺五加酸预处理30 min,加入50 mM EtOH联合1μg/mL脂多糖(LPS)时间为30 min。蛋白印迹与PCR验证LX-2细胞激活过程中刺五加酸对于AMPK、IRAK4、炎症因子、NOD样受体家族成员NLRP3和天冬氨酸蛋白水解酶1 caspase1表达。(2)急性酒精灌胃模型中,C57BL/6小鼠24只,随机分成四组:正常组、EtOH 组、EtOH+AA-20 组和 EtOH+AA-40 组。EtOH+AA-20 和 EtOH+AA-40 组通过灌胃给药,连续14天。同时,正常组和EtOH组给予等体积的生理盐水,连续14天。接下来,除正常组外,其他组在24 h内给予三次酒精灌胃(5 g/kg体重)。所有小鼠在最后一次酒精灌胃9h后处死,经乙醚麻醉后,颈动脉采血。利用蛋白印迹法检测Toll样受体家族的蛋白表达情况,对肝脏病理切片进行染色分析肝纤维化与炎症因子浸润情况。利用200 mM EtOH联合1 g/mL LPS刺激大鼠肝星状细胞1h,加入不同浓度的刺五加酸继续孵育6 h,收集细胞。油红染色法检测细胞中脂肪着色情况。ELISA法检测细胞因子白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达情况。蛋白印迹检测脂肪合成蛋白SREBP1、Lipin家族蛋白、以及TLR4信号通路相关蛋白的表达情况。同时利用细胞荧光法检测α-SMA、Lipin1和IRAK4的表达情况。(3)建立TAA诱导的肝纤维化模型,C57BL/6小鼠40只,随机分成五组:正常组、TAA 组、TAA+CuE-5 组、TAA+CuE-10 组和 TAA+Cur-20 组。除正常组外,其余小鼠第一周腹膜注射三次100mg/kgTAA,随后四周,每周腹腔注射三次200 mg/kgTAA。葫芦素E组和姜黄素组中的小鼠分别灌胃葫芦素E(5或10 mg/kg)或姜黄素(20 mg/kg)5周。第五周给药结束9 h后处死小鼠,收集血清,肝脏等标本。H&E法、Masson染色法以及天狼猩红染色法分析肝纤维化与炎症因子浸润情况。利用免疫组织化学染色法检测肝纤维化标志物α-SMA、丝氨酸/苏氨酸激酶-蛋白激酶B(Akt)和AMPK的磷酸化水平情况。葫芦素E对活化的肝星状细胞的调控作用中,采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化的大鼠肝星状细胞(t-HSC)观察凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、Bax、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、Caspase3、c-JunN-末端激酶(JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(p38)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化表达以及纤维化标志物α-SMA、TIMP-1、Collagen-Ⅰ的蛋白或mRNA表达。蛋白印迹法检测葫芦素E对于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、AKT和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化表达对比PI3K抑制剂LY294002的效果。结果:(1)慢性酒精导致体内ALT、AST和LPS的水平上升,肝组织发生大量脂肪变性,肝纤维化相关各项指标α-SMA、Collagen Ⅰ以及IRAK和炎症因子的蛋白和mRNA表达升高,而SIRT1、p-AMPK和p-LKB1的蛋白表达下降。预处理刺五加酸可以有效逆转上述因子的表达。体外实验结果显示,刺五加酸可以显著抑制经 EtOH/LPS 导致的 IL-1β、IL-1α、IL18、NLRP3、IL-6、Caspase-1 和 TNF-α的释放,降低IRAK4的蛋白和mRNA表达。(2)急性酒精模型中,刺五加酸可以降低急性酒精诱发的ALT/AST指标升高,在病理学上改善模型组的病变情况以及抑制TLR4、IRAK1、IRAK4、TRAF3、p-TAK1和NF-κB(p65)的蛋白表达。刺五加酸能够有效降低EtOH/LPS导致TNFα、TGFβ、IL6 和 MCP-1 水平,抑制 SREBP1,α-SMA 和 CollagenⅠ的表达。EtOH/LPS能够导致磷脂酸磷酸酯酶(Lipin-1)的表达升高,而预处理刺五加酸后能够显著下降Lipin-1的表达。预处理刺五加酸同样显著降低TLR4、CD14、IRAK1、IRAK4、TRAF3、p-TAK 和 NF-κB(p65)的蛋白表达。此外 EtOH/LPS能够显著减少SIRT1、p-LKB1、p-ACC和PPARα的蛋白表达,并且增加PPARγ的表达,给予刺五加酸后,能够有效逆转上述指标。(3)TAA所致的肝纤维化模型中,葫芦素E可以在体内降低TAA引起的Akt、mTOR、PI3K以及P70S6K的磷酸化表达,降低纤维化标志物α-SMA、TIMP-1和Collagen-Ⅰ的表达,增加AMPK的磷酸化表达。在病理学上减少肝细胞变性和胶原纤维的存在。葫芦素E能够剂量和时间依赖性抑制t-HSC细胞增殖。葫芦素E剂量和时间依赖性抑制caspase1及其底物的裂解,调节BCL-2与Bax的比率,增加细胞色素C的表达,并且结合膜联蛋白-Ⅴ和碘化丙啶作为荧光探针的流式细胞方法确认12.5 μ葫芦素E诱导t-HSC凋亡。葫芦素E浓度和时间依赖性抑制TNF-α刺激的ERK的磷酸化,抑制α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表达。12.5 μM葫芦素E与AICAR和二甲双胍相似显著上调AMPK的磷酸化,下调p-mTOR的表达,同样抑制p-PI3K和p-Akt的表达,作用效果与 LY294002 一致。结论:刺五加酸和葫芦素E对肝纤维化表现出较好的调控作用:1.刺五加酸通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节慢性酒精导致的肝纤维化和脂质沉积,特别是通过抑制IRAK1/4信号通路来调控体内脂肪酸的平衡和炎症反应的发生。2.刺五加酸能够抑制急性酒精小鼠体内的肝损伤,调节体外酒精和LPS联合刺激HSC-T6细胞活化。3.葫芦素E可以调节PI3K/Akt,AMPK和mTOR信号改善TAA诱导的肝纤维化。4.葫芦素E能够有效降低肝星状细胞的细胞活性。葫芦素E能够抑制PI3K/Akt的磷酸化,激活AMPK磷酸化,减少细胞外基质沉积和α-SMA、CollagenⅠ的蛋白表达。但是它们作为有效的药物,还需要进一步深入研究,确定最好最准确的抗肝纤维化药物。