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背景:原发性肝癌是由肝细胞或肝内胆管细胞发生的恶性肿瘤。其发病率在消化系统肿瘤中占第三位,全球每年有25万人,我们国家有11万人死于肝癌。目前其首选的治疗方法为根治性手术切除,但是术后五年的复发率及转移率仍然居高不下,预后极差,从诊断到死亡平均生存期为1-4月。迁徙和转移能力是恶性肿瘤最重要的生物学行为之一,淋巴道转移是上皮组织来源恶性肿瘤早期转移的主要方式,在原发性肝癌中,淋巴道转移占7.45%。本研究所选用的Hca/A2(Hca-P)细胞和Hca/16A3(Hca-F)细胞是来源于同一亲本的细胞株,却具有不同转移能力的小鼠肝癌腹水型细胞。Hca-F细胞具有高淋巴道转移能力,淋巴结转移率约大于75%,而Hca-P细胞具有低淋巴道转移能力,淋巴结转移率约小于25%。本课题组前期研究已利用抑制性消减杂交技术、基因芯片技术、定量蛋白质组学技术等,筛选出了Hca-F细胞和Hca-P细胞差异性表达的基因,在Hca-F细胞中有21个高表达,而在Hca-P细胞中仅有3个高表达。如膜联蛋白A7(Annexin A7,Anxa7)等,Anxa7基因在Hca–F细胞中的表达明显高于Hca–P细胞。前期研究已发现这些基因可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移相关。恶性肿瘤的发生,是肿瘤细胞分裂与细胞凋亡平衡失调所致,这种平衡的紊乱可以发生在肿瘤细胞凋亡的任何环节当中。体内和体外的研究均提示,凋亡在肿瘤发生、发展过程中发挥重要的作用。很多学者研究提示,Anxa7的异常表达与多种恶性肿瘤的形成、迁徙及转移密切相关。因而,对肝癌淋巴道转移潜能的相关Anxa7基因及蛋白质的研究,有助于阐明肝癌淋巴道转移的机制,为临床应用提供新的治疗思路。Anxa7有两种表达亚型,分别为47k Da和51k Da,51k Da亚型蛋白在成熟肌组织中较为常见,而脑和心脏中两种亚型均存在。本实验选择以低淋巴道转移能力的细胞株为研究对象,通过下调Anxa7基因表达后,确定何种亚型Anxa7对Hca-P凋亡、增殖及迁徙有影响,并探索该亚型参与调控相关凋亡蛋白及其通路的机制。目前研究发现,细胞凋亡存在三条主要通路:内源性线粒体通路、外源性死亡受体通路及内源性内质网通路途径。在不同的凋亡通路中有多种蛋白参与调控凋亡。研究发现,Bcl-2家族在细胞线粒体凋亡通路中发挥重要作用,Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素。Bcl-2属于抗凋亡蛋白,有抑制细胞凋亡的作用,而Bax是促凋亡蛋白,有促进细胞凋亡的作用。Caspase是一类蛋白酶家族,成员较多,可分为3个亚族:Caspase-1、4、5、11属于Caspase-1亚族;Caspase-2、9属于Caspase-2亚族;Caspase-3、6、7、8、10属于Caspase-3亚族。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基,可以选择性地切割某些蛋白质,从而造成细胞凋亡。死亡受体为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的跨膜蛋白受体,主要由Fas/Fas L介导,进而活化caspase-8,形成Fas、Fas L、caspase-8构成的蛋白复合体,其作用与线粒体途径形成的凋亡小体相似,具有裂解并活化caspase-3的作用,引起细胞凋亡的级联反应,导致细胞凋亡发生。本实验通过下调47k Da Anxa7表达后,检测Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase 8、Caspase 12、Fas、Fas-L及Cytochrome C凋亡相关蛋白的改变,进而揭示47k Da Anxa7参与的凋亡通路。此外本实验还通过采用线粒体膜电位、免疫共沉淀及WB等方法,进一步验证47k Da Anxa7参与的凋亡通路及相关凋亡蛋白的分布与改变。目的:1.构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表达载体,稳定转染至低淋巴道转移细胞株Hca-P细胞中,得到Pd细胞、Pdn细胞。2.研究小鼠肝癌P、Pdn及Pd细胞组中,47k Da与51k Da Anxa7在三组细胞中不同亚细胞定位及表达的变化。3.研究小鼠肝癌Hca-P细胞47k Da Anxa7基因表达水平下调后,P、Pdn及Pd细胞组凋亡及迁徙能力的变化。4.研究小鼠肝癌Hca-P细胞47k Da Anxa7基因表达水平下调后,P、Pdn及Pd细胞组细胞增殖能力及凋亡相关蛋白Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Bax、Caspase-12、Fas、Fas L、Caspase-8的表达变化。5.研究小鼠肝癌Hca-P细胞47k Da Anxa7基因表达水平下调后,Anxa7参与的凋亡通路相关机制的探索。方法:1.构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得Pd、Pdn,P细胞为阴性对照。2.应用QRT–PCR在m RNA水平验证,Hca-P细胞在Anxa7基因表达水平表达下调。3.应用Western blot在蛋白质水平验证,47k Da与51k Da Anxa7表达水平表达下调。4.采用亚细胞蛋白质组学的方法,将P、Pdn及Pd细胞组进行亚细胞组分的提取,并用WB方法对不同亚细胞组分中47k Da与51k Da Anxa7基因两种亚型进行定位和表达对比。5.利用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化;应用Transwell小室检测细胞迁徙能力的变化;利用CCK-8实验检测细胞增殖能力的改变。6、应用Western blot检测三组细胞中Bcl-2、Bax、Fas-L、Fas、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12凋亡相关蛋白的变化。6、应用流式细胞仪,检测细胞线粒体膜电位的变化。7、应用免疫共沉淀技术检测与Anaxa7共沉淀的蛋白;采用亚细胞蛋白质组学的方法,并用Western blot方法对各个亚细胞组分中Bcl-2进行定位和表达比较。结果:1.表达载体成功构建;并稳定转染至Hca-P细胞。2.Real time q RT-PCR结果验证,Hca-P细胞Anxa7基因表达水平明显下调。3.Western blot结果验证,47k Da Anxa7在Pd细胞组中蛋白表达水平较P细胞组及Pdn细胞组明显降低(P<0.05),而在P与Pdn细胞组间无明显差异(P>0.05);亚细胞定位及表达显示,在Anxa7基因表达下调后,47k Da Anxa7在P与Pdn细胞组中同时表达于细胞浆与线粒体;而51k Da Anxa7主要表达于线粒体。4.流式细胞仪检测47k Da Anxa7基因表达下调后,Pd细胞凋亡明显高于P细胞和Pdn细胞(P<0.05),P细胞和Pdn细胞之间无明显差异(P>0.05)。细胞迁徙实验检测Pd细胞细胞迁徙能力明显低于P细胞和Pdn细胞(P<0.05),P细胞和Pdn细胞之间无明显差异(P>0.05)。CCK-8增殖实验检测结果提示三组细胞数量在24小时内无显著差异(P>0.05),在24到72小时的过程中,Pd细胞增殖能力明显低于P细胞和Pdn细胞(P<0.05),P细胞和Pdn细胞增殖能力在各时间段无显著差异(P>0.05)。5.47k Da Anxa7基因表达下调后Bcl-2在Pd细胞组明显低于P细胞和Pdn细胞组,有显著差异(P<0.05),Caspase-3、胞浆Cyt-C表达在Pd细胞组明显高于P细胞和Pdn细胞组,有显著差异(P<0.05);Bax、线粒体中Cytochrome-C、Caspase-12、Fas、Fas-L及Caspase-8表达在P细胞、Pdn细胞和Pd细胞组之间无明显差别(P>0.05)。6.线粒体膜电位的变化结果显示,下调47k Da Anxa7表达的Pd细胞组线粒体膜电位水平降低P细胞组和Pdn细胞组(P<0.05);而P细胞组与Pdn细胞组之间无明显差异(P>0.05)。7.免疫共沉淀实验显示P细胞组中Anxa7与Bcl-2发生共沉淀;而未见Anxa7与Bax发生共沉淀。8.Western blot方法检测发现,P细胞组中47k Da Anxa7与Bcl-2在线粒体与细胞浆都有表达,51k Da Anxa7仅表达于线粒体中;在下调47k Da Anxa7表达后,Bcl-2在线粒体与细胞浆的表达都随之减少。结论:1.利用目的基因成功构建了表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得Pd细胞、Pdn细胞。2.Hca-P细胞中有47k Da与51k Da Anxa7两种亚型表达;主要分布于胞浆及线粒体;Pd细胞中47k Da Anxa7在胞浆及线粒体的表达均减少。3.47k Da Anxa7具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和迁徙的能力,提示47k Da Anxa7在小鼠肝癌淋巴道转移机制中起促进作用,并参与细胞凋亡过程。4.47k Da Anxa7主要通过影响抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并通过线粒体凋亡相关通路参与凋亡过程。5.47k Da Anxa7介导的凋亡可能与外源性死亡受体凋亡通路及内源性内质网凋亡通路无关。6.47k Da Anxa7通过影响Hca-P细胞线粒体膜电位以及改变Bcl-2蛋白在线粒体与胞浆内的表达,促进细胞凋亡。7.47k Da Anxa7与Bcl-2发生共沉淀,未见与Bax发生共沉淀。8.47k Da Anxa7可以作为肿瘤凋亡治疗的一个潜在药物治疗靶点。