胃癌在癌症中致死率居世界癌症致死率第3位,每年全球都有超过100万人被诊断为胃癌,并且有85万人死于该病。在西方国家,胃癌的5年生存率为5%-20%,与此相对,日本胃癌的5年生存率为50%,造成各国胃癌生存率不同的原因在于胃癌的能否早期诊断。内窥镜检查是筛查早期胃癌的最佳方法,通过此方法可以大大减少胃癌的致死率。但是内镜检查是有创检查,可能引发如吸入性肺炎,穿孔,出血等多种并发症。因此,内镜检查无法作为胃癌筛查手段在社会普及。正因为如此,发现可以用于早期诊断的非侵入性的胃癌检测手段十分必要。传统的用于胃癌早期诊断的肿瘤标志物诸如CA72-4、CEA、CA125、CA19-9、AFP的特异性和灵敏度很低。发现高灵敏度和特异度的肿瘤标志物对于胃癌的早期筛查至关重要。在中国,胃癌的发生率和致死率居癌症发生率和致死率的第二位,大部分胃癌死亡病例都与胃癌的腹膜转移相关。胃癌的转移方式包括直接侵犯邻近脏器,淋巴转移,血行转移和种植播散。胃癌腹膜转移是指胃癌原发灶癌细胞经血行、淋巴或腹膜直接种植生长所致的癌症转移形式。将近20%的胃癌患者在术前或术中诊断有腹膜转移,腹膜转移程度越高,生存期越短。根治性切除术是胃癌的治愈的有效手段,而大多数患者首诊时已处于癌症晚期丧失了手术机会。因此,发现用于胃癌早期诊断标志物具有重要意义。胃癌的易感性大部分是通过遗传获得的,有好多与此相关的基因被发现。一些基因与细胞信号通路相关,调节细胞周期、细胞增殖和DNA的修复。Legumain(LGMN)是来自天冬酰胺内肽酶家族的一个溶酶体半胱氨酸内肽酶。它在胃癌腹膜转移患者中过表达,并且表达水平越高病情进展越快,病情结局越差。LGMN在正常组织中几乎不表达,包括在癌症附近组织中也很少表达,在实体肿瘤中或肿瘤微环境中(肿瘤组织、肿瘤基质、内皮细胞)都过表达。并且,LGMN与肿瘤发展、恶化、预后不良相关。有研究证实,LGMN在不同的癌症中过表达,并且通过激活MAPK和Akt信号通路来促进胃癌的上皮间质转化和胃癌的转移。我们首先检测了胃癌患者的组织标本,发现存在腹膜转移的胃癌患者LGMN表达水平明显高于没有腹膜转移的患者,且LGMN表达水平与间叶细胞的标志物的表达水平具有相关性。这项特性源自于前明胶蛋白原的激活导致的基质的降解,这可能就是肿瘤细胞获得侵袭和转移表型的原因。在胃癌患者中,LGMN表达量显著增高,并且与肿瘤的临床分期及发生远处转移相关。然而,在胃癌发生转移的过程中,是什么影响了LGMN表达量,这一机制尚不明确,这也是本课题的研究方向。目前,LGMN表达水平的调节机制尚不明确,LGMN在基因转录后的水平暨m RNA水平过表达。mi RNA可以通过抑制m RNA的翻译或者降解m RNA来进行基因的表达调控。mi RNA是一系列非编码RNA,长度为19-23个碱基的核糖核酸分子。mi RNA表达异常与胃癌的分期、大小、转移息息相关。在胃癌中,mi RNA可以干扰细胞的信号通路,抑制抑癌基因的活性,影响细胞周期。mi RNA可以通过外泌体从癌症组织分泌进入体液,包括血浆,尿液,泪液,羊水,胃液等。另外mi RNA具有极强的稳定性和持久性,甚至几年下来,福尔马林固定,石蜡包埋的组织样本或者体液样本中的mi RNA依然稳定。因此,异常表达的mi RNA可以作为胃癌早期筛查,诊断,判断预后的有效肿瘤标志物。在胃癌中,mi R-23a通过使靶基因IL6R沉默可以显著促进胃癌细胞的增殖]。在癌症组织中,一些致癌的mi RNA大量上调从而抑制下游的抑癌基因,例如mi R-21可以直接抑制肿瘤抑制基因RECK,来加速胃癌细胞的增殖,抑制胃癌细胞的凋亡。mi R-218可以定向作用于Robo1来激活Slit/Robo1信号通路从而促进肿瘤的侵袭和转移。在多种恶性肿瘤中,mi RNA可以通过上调细胞周期素的表达或者下调其他细胞周期因子,p16家族,p21家族的表达来影响细胞周期的进程。在胃癌中,mi RNA可以干扰细胞的信号通路,抑制抑癌基因的活性,影响细胞周期。大量的mi RNA被认为是通过EMT相关机制/非EMT相关机制调节肿瘤细胞的侵袭和转移。目前已经发现有多种mi RNA例如mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141,and mi R-429等,可以调控EMT过程。目前研究表明,mi RNA的异常表达与胃癌的分期、肿瘤大小、分化程度以及转移关系密切,本研究经原位预测算法推测LGMN可能是mi RNA-3978定向作用的靶点。mi RNA-3978在有腹膜转移的胃癌肿瘤组织中和腹膜转移的胃癌细胞系MKN45细胞中,含量都显著降低。为了验证LGMN和mi RNA-3978是否存在相互作用,我们选取了高度分化的模拟胃癌腹膜转移的细胞系MKN45和人类间皮细胞系HMr SV5来进行进一步研究。为了探讨LGMN的LGMN的3’非翻译区(3’UTR区)是否可以和mi RNA-3978作用,我们向HMr SV5和MKN45细胞内转染了含有3’UTR区的野生型荧光素酶报告基因载体,LGMN的3’非翻译区(UTR)进行荧光素酶报告载体实验显示,LGMN可以与野生型mi R-3978相互作用但是不能与mi R-3978突变型相作用,说明LGMN是mi R-3978的靶基因。为了探索mi RNA-3978的表达水平是否影响细胞的增殖活性和迁移、侵袭能力,我们在MKN45细胞系中转染了mi RNA-3978的近似物,之后进行了MTT实验检测细胞活性。在细胞系MKN45中,异位表达mi R-3978的模拟物可以显著降低细胞的增殖能力,并且可以抑制体外细胞的迁移和侵袭。我们已经证明了在MKN45细胞系中,mi RNA-3978可以抑制肿瘤细胞的生长,因此我们希望可以进一步在小鼠胃癌模型中看见同样的抗肿瘤效应,结果发现,在小鼠模型中,mi R-3978模拟物通过调节LGMN蛋白的表达水平,来抑制胃癌的生长和转移。根据我们的实验数据,LGMN是mi RNA-3978作用的靶点,由此我们推测mi RNA-3978表达抑制可能与胃癌患者发生腹膜转移的发病机制相关。并且我们发现,在20位处于不同阶段的胃癌转移患者中,LGMN含量与mi R-3978含量呈负相关。取得的主要进展:1.存在腹膜转移的胃癌患者肿瘤组织的LGMN表达水平明显高于未发生腹膜转移的患者,且LGMN表达水平与间叶细胞的标志物的表达水平具有相关性。2.经两种原位作用算法(Target Scan和micro Cosm)推算,有4个非保守mi RNA,可能作用于LGMN。对有腹膜转移的胃癌患者的肿瘤组织标本进行检测,mi RNA-3978是唯一一个显著下降的mi RNA。3.通过荧光素酶报告基因载体实验,我们发现LGMN是mi RNA-3978作用靶点。4.mi RNA-3978的表达水平影响细胞的活性和迁移侵袭能力。5.在小鼠胃癌模型中,mi RNA-3978的表达量与LGMN表达量呈负相关,mi RNA-3978的表达量的增高可以抑制胃癌的形成与进展。6.在20位伴有腹膜转移的胃癌患者肿瘤组织标本中,mi RNA-3978表达量的降低与LGMN表达量的升高呈负相关。综上,我们的结果提示mi RNA-3978表达量的降低导致了LGMN表达量的升高,mi RNA-3978可以作为胃癌腹膜转移的肿瘤标志物。与此同时,我们也面对的许多巨大挑战,例如找到大量采集样本的标准化方法,并验证它在临床应用上的重要性等。基于目前所知现状,关于mi RNA-3978作用靶点的系统性研究还不够充分。在转移性胃癌患者中,是否还有其他已知的或未知的mi RNA-3978的靶点,以及这些靶基因是否与胃癌腹膜转移的病理过程相关还不可知,关于这些问题的研究值得更加深入的进行。