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目的： 肠道病毒71型(Enterovirus71EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus),是引起手足口病(HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病的主要致病菌。近年来,手足口病发病率显著升高,并呈现从季节性流行变为全年散发的趋势。EV71的VP1蛋白是该病毒的主要的病毒中和决定因子,它直接决定病毒的抗原性。因此,EV71VP1蛋白的抗原性与其他生物学特性的研究具有重要的临床意义。 本课题通过对肠道病毒71(EV71)VP1基因进行扩增、克隆、序列分析、生物信息学分析、原核表达、纯化,并使用纯化的重组蛋白通过酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassayELISA)检测患者的免疫反应性,为临床诊断及疫苗研究奠定基础。 方法： 根据GenBank中EV71序列(EU703813.1)设计一对特异性引物,采取儿童的咽拭子标本,提取病毒核糖核酸,以此核酸为模板,RT-PCR扩增EV71VP1。PCR产物纯化后经BamHI和XhoI酶切,酶切产物纯化后与相应酶切纯化的pET28a连接,连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α,挑取卡那筛选阳性菌落,提取质粒并用双酶切鉴定。将鉴定后质粒转化大肠杆菌E.coliBL21,经双酶切及测序鉴定后,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(Westernblot)分析表达结果。并对测序结果进行生物信息学分析,对表达的蛋白进行纯化,纯化后的蛋白包被反应板,用ELISA法分别检测EV71阳性与COXA16阳性病人VP-1IgG抗体,并进行统计学分析。 结果： 以手足口病患儿咽拭子标本提取的RNA为模板,RT-PCR获得891bp的DNA片段,与预期目的片段大小一致,并将其成功克隆入pET28a载体。经BLAST比对显示基因同源性与GenBank登录号为JQ766207.1一致性达99％。经IPTG诱导获得分子量约32KD的融合表达蛋白,与预期分子量相符。通过包涵体纯化得到VP1高纯度蛋白,以纯化蛋白包被反应板检测EV71阳性、COXA16阳性病人的血清标本,EV71阳性病人OD值均值2.385±0.628,COXA16阳性病人OD值均值1.231±0.428,正常对照组OD值均值0.384±0.128。EV71VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为83.3%和85%。 结论： 成功构建了EV71VP1基因高效原核表达载体pET28a-EV71VP1,并获得蛋白的大量表达;通过对感染病人血清的ELISA初步分析,得出EV71VP1敏感性和特异性分别为83.3%和85%,为后续的疫苗和检测试剂盒研究奠定基础。