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杜氏藻(Dunaliella)广泛分布于世界各地的盐湖和海水中,是一种单细胞绿藻,归属于绿藻纲(Chlorophyceae)、绿藻门(Chlorophyta).杜氏藻属的野生生活环境最明显的特点是富含Na<+>和Cl<->,尽管从各地分离到的野生型株系对NaCl的承受范围和最适生长浓度有所不同,但还是可以看出它们对NaCl有很大的适应浓度范围.因此中国常称杜氏藻为"盐藻".盐藻中尤以Dunaliella.salina的盐适应能力最强,能够在0.1-饱和盐浓度范围内生存.该文选择盐藻Dunaliella.sallna作为研究材料,就盐藻的渗透调节力以及超微结构与渗透调节的关系作了详细的研究.并且对盐藻耐盐相关基因——烯醇酶基因进行了克隆和转基因功能鉴定.研究结果如下:利用扫描电镜和透射电镜对盐藻的超微结构进行了观察:盐藻Dunaliella sallna具有薄而不均匀的外被膜.鞭毛"9+2"结构.眼点位于细胞质中.内质网丰富.线粒体形状多样.叶绿体呈"杯形".首次在杜氏藻中发现两个大型造粉粒.细胞核位于叶绿体凹窝中,核仁存在时期很短.在高渗震动下,细胞体积明显变小,胞内细胞器如叶绿体、线立体、高尔基体等的体积也相应变小,这些细胞器的膜部分融合至内质网膜中,使内质网的表面积增大.针对基因同源性克隆中存在的问题,采用改进简并PCR法对盐藻具抗逆功能的烯醇酶基因进行克隆.改进后的同源引物简并度从1000倍以上降低至100倍以下,利用RT-PCR成功地扩增出一条630bp的盐藻cDNA片段,该片段与其它物种的烯醇酶基因具有很高的相似性.在此基础上进行5和3RACE获得了盐藻烯醇酶基因的全长cDNA,其长度为1734bp.通过生物信息学的方法将所克隆的序列进行了分析.对眼藻进行了不同的渗透震动:从1.5M NaCl到0.5M NaCl的低渗震动和从1.5M NaCl到3.0M NaCl的高渗震动.选择盐藻23SRNA作为内标基因,利用半定量RT-PCR对经不同渗透震动后(0-48小时)烯醇酶基因转录水平的表达量进行了测定.采用农杆菌转化系统转化模式植物烟草.以载体pCAMBIA2301为骨架引入pBI121中的gus基因,构建了简便、实用的中间载体pCAMBIA2301G.并将其中的一个gus基因用目的片段烯醇酶基因转换,构建了可以在植物中高效表达的载体pCAMBIA2301G-enolase,成功地将其转入根癌农杆菌EHA105中,为下一步进行转基因植物的研究作准备.选用了农杆菌介导的烟草叶盘转化法进行基因转化.叶盘经农杆菌侵染以后,在含卡那霉素的MS<,2>培养基上诱导丛生芽,丛生芽在MS<,3>培养基上诱导生根,生根率达到80﹪左右,最后将PCR阳性苗移栽到蛭石:沙(1:1)的培养介质中培养,得到转基因再生苗.采用PCR、Southern杂交、Northern杂交对转基因再生苗进行了分子生物学鉴定.