应用反向遗传系统实现RNA病毒的拯救,从而在DNA水平上对RNA病毒进行遗传操作,为深入研究RNA病毒的分子生物学及病毒与宿主的相互作用提供了新的手段。绝大多数杯状病毒不能够在体外培养,严重阻碍了这类病毒的研究,猫杯状病毒为杯状病毒科中少数能在体外培养的病毒之一,本研究选择猫杯状病毒CH-GD分离株,克隆其全基因组cDNA,尝试建立RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传系统,拯救含遗传标记的FCV。1.FCV CH-GD株全长cDNA分子克隆设计并合成了覆盖FCV CH-GD株基因组的]对引物,以本实验室保存的含有FCV CH-GD株全长基因组的pUC-FCV质粒为模板,采用PCR方法扩增FCV全长基因组。通过沉默突变引入一分子标记(MluⅠ识别位点)以便于区分野毒株和拯救毒。改造pCDNA载体,并在其3端引入核酶(pCDNA-HDVRZ)。(?)(?)CH-GD株全基因组插入载体,构建CH-GD株基因组的全长cDNA克隆(pCDNA-HDVRZ-FCV),并以PCR、限制性内切酶酶切和基因组测序等方法对pCDNA-HDVRZ-FCV进行鉴定,结果表明已成功构建了FCV CH-GD株的全长cDNA分子克隆。该克隆不仅含有CH-GD株的全基因组序列,还含有核酶序列和一个分子标记(MluⅠ识别位点)。2.拯救病毒的鉴定以pCDNA-HDVRZ-FCV为模板,用脂质体转染法(LipofectamineTM 2000)将FCV基因组全长cDNA分子克隆导入F81细胞,利用聚合酶Ⅱ系统进行体内转录。盲传三代后可观察到典型的FCV致细胞病变效应。使用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明拯救病毒成功,获得了感染性cDNA分子克隆。通过对感染性分子克隆分子标志的鉴定,排除了自然毒株的污染。3. RHDV VP60在F81细胞上的表达用KpnⅠ和NotⅠ分别将本实验室构建的两个转移载体和pUC-FCV进行双酶切,采用粘端连接将RHDV VP60基因带入FCV全基因组中不同位点。成功构建了将RHDV VP60插入FCV全基因组中的质粒(LC之后和VP1之后)。采用脂质体转染法将质粒导入F81细胞,转染48h后,应用间接免疫荧光法能够检测到RHDV VP60的表达,继续传代,发现荧光变弱,至第七代检测不到荧光,RT-PCR结果也为阴性。试验结果表明,重组病毒可以在F81细胞中表达VP60,但是不能形成稳定的可感染的重组病毒。总之,FCV反向遗传研究系统的建立将为深入研究其功能基因组学以及致病和变异的分子机制奠定基础,同时还具有将FCV开发成载体用于基因治疗或研发新型疫苗的潜在应用前景。