论文部分内容阅读
卵巢癌是一种多发的的妇科恶性肿瘤,由于卵巢癌早期症状不明显,约70%的患者在确诊时已为晚期,且复发率与耐药性高,导致卵巢癌致死率非常高,居妇科肿瘤之首,患者的5年生存率仅30%,对女性健康造成了严重威胁。当前,临床上大多采取手术结合铂类、紫杉醇等手段对卵巢癌进行治疗。但是,目前使用的抗肿瘤药物的毒、副作用较大,而且肿瘤细胞容易产生药物抗性,因此,从自然界天然存在的化合物中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物对卵巢癌的临床治疗具有重大意义。甲基莲心碱是提取自莲子心的一种双苄基异喹啉类生物碱。具有抗炎、抗氧化以及化疗增敏等多种药理功效,而且可以抵抗肿瘤细胞的耐药性。近年来研究表明,甲基莲心碱可通过诱导细胞周期阻滞、细胞自噬及细胞凋亡抑制多种肿瘤细胞的体外增殖。自噬是细胞内损伤或有害成分降解和再循环的关键机制之一,能够调节新陈代谢及维持能量平衡。研究发现,自噬具有双重作用,不同细胞及不同刺激条件下,自噬发挥着促进细胞存活或者促进细胞死亡的双重作用。一方面,自噬通过增强细胞的自我保护活动从而帮助细胞度过危机,避免死亡；然而,过度的自噬不可逆转最终引发细胞死亡。据报道,多种抗肿瘤因子通过诱导自噬而抑制肿瘤细胞的增殖。本课题组先前的结果表明,甲基莲心碱可以显著抑制人乳腺癌及成骨肉瘤细胞增殖,但是,甲基莲心碱是否能抑制人卵巢癌细胞的生长及其可能的分子机制尚未见报道。探究甲基莲心碱对卵巢癌细胞是否具有生长抑制作用及其具体的分子机理,对进一步了解甲基莲心碱的抗肿瘤机理和卵巢癌治疗具有重要价值。为了探究甲基莲心碱是否可以抑制人卵巢癌细胞的增殖及其作用机制,我们开展了以下研究工作：1. 甲基莲心碱对卵巢癌细胞及正常输卵管上皮细胞的生长抑制作用为了明确甲基莲心碱对卵巢癌细胞及正常输卵管上皮细胞的生长抑制作用,我们选取人卵巢癌细胞A2780、H08910、SKOV3与正常输卵管上皮细胞FTE187进行实验。通过噻唑蓝比色法和平板克隆形成实验分析甲基莲心碱对卵巢癌细胞及FTE187细胞的生长抑制效果。MTT实验结果显示：甲基莲心碱对多种人卵巢癌细胞均具有显著的生长抑制作用并具有浓度与时间依赖性。平板克隆形成实验结果表明卵巢癌细胞的克隆形成能力随着甲基莲心碱作用浓度的增加逐渐降低,与对照组相比有显著差异,该结果进一步证明了甲基莲心碱对卵巢癌细胞的生长抑制效果。甲基莲心碱对正常输卵管上皮细胞FTE187的毒性显著低于卵巢癌细胞。2.甲基莲心碱诱导卵巢癌细胞周期阻滞及机制诱导细胞周期停滞是许多抗肿瘤药物抑制肿瘤生长的机制之一。为此,我们采用流式细胞仪及Western Blotting等手段探究甲基莲心碱对卵巢癌细胞周期的作用及其分子机制。(1)甲基莲心碱处理A2780细胞后检测细胞周期发现： G1期细胞所占百分比随着甲基莲心碱浓度的增加而逐渐升高,从55.1%(对照)分别增加到56.6%(5 μ M)和79.5(10 μM),S期细胞所占的百分比则随着甲基莲心碱浓度的增加而逐渐降低,分别为30.97%(对照),31.96%(5 u M)17.92%(10 μ M)。(2)Western Blotting测定甲基莲心碱作用于A2780细胞后G1期阻滞相关蛋白的表达情况显示：甲基莲心碱处理A2780细胞后p21与p27的表达显著升高,而cyclinDl的表达明显降低,cyclinE表达则没有明显变化。这说明甲基莲心碱通过增强p21与p27的表达而抑制cyclinDl的表达导致卵巢癌细胞A2780 G1期阻滞,与cyclinE无关。3.甲基莲心碱对卵巢癌细胞自噬和凋亡的作用及其分子机制诱导自噬及凋亡是抗肿瘤药物抑制肿瘤生长的又一机制。为明确甲基莲心碱是否能够诱导卵巢细胞自噬及相应的分子机制,我们首先采用GFP-LC3单荧光体系示踪法及透射电镜观察法对甲基莲心碱处理后卵巢癌细胞的自噬情况进行检测；然后通过Western Blotting检测了AKT、p38 MAPK、JNK1/2、mTOR信号通路及自噬相关基因的LC3 Ⅱ、Atg7等蛋白的变化；此外,采用Annexin V-PI双染法检测甲基莲心碱处理后卵巢癌细胞A2780的凋亡情况。(1)甲基莲心碱能够导致卵巢癌细胞自噬。GFP-LC3单荧光体系示踪法及Western Blotting检测甲基莲心碱对卵巢癌细胞A2780自噬的影响。结果显示：甲基莲心碱能够诱导卵巢癌细胞A2780发生自噬,且自噬小体聚集数量及自噬相关蛋白Atg7、LC3 Ⅱ的表达水平随药物剂量的增大而升高。(2)甲基莲心碱诱导的卵巢癌细胞自噬与mTOR信号通路相关。Western Blotting检测p70S6K、4EBP1的磷酸化水平,结果显示：p-p70S6K、p4EBP1表达水平随药物浓度的升高而降低,且呈浓度和时间依赖性。提示甲基莲心碱诱导的卵巢癌细胞自噬与mTOR信号通路相关。(3)甲基莲心碱诱导的卵巢癌细胞自噬依赖于p38 MAPK和JNK1/2信号通路的激活。Western Blotting检测甲基莲心碱处理后p38 MAPK、JNK及AKT等信号通路的变化情况。结果显示：10μM甲基莲心碱能够明显激活p38 MAPK和JNK1/2通路,AKT通路则没有显著变化。这提示p38 MAPK和JNK1/2可能参与甲基莲心碱诱导的细胞自噬的发生过程。为了探究p38 MAPK与JNK1/2信号通路在甲基莲心碱诱导的自噬中是否发挥作用,分别用p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK1/2抑制剂SP600125抑制A2780细胞p38 MAPK激酶活性和JNK1/2激酶活性后,检测自噬相关蛋白LC3 Ⅱ的表达水平。结果表明：相对于对照组,SB203580和SP600125均能显著抑制甲基莲心碱诱导的LC3 Ⅱ的积累,这提示甲基莲心碱诱导的卵巢癌细胞自噬依赖于p38 MAPK和JNK1/2的激活。(4)Annexin V-PI双染法测定甲基莲心碱处理A2780后的凋亡情况。结果表明：随着甲基莲心碱浓度的增加,细胞的凋亡率逐渐升高,且具有浓度依赖性。综上所述,我们研究发现,甲基莲心碱可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖而对正常细胞毒性较小；甲基莲心碱通过增强p21、p27的表达及抑制cyclinDl的表达诱导卵巢癌细胞G1期阻滞；更为重要的是,我们发现甲基莲心碱可诱导卵巢癌细胞发生自噬和凋亡,除了mTOR通路的失活,甲基莲心碱引发的卵巢癌细胞自噬也依赖于p38 MAPK和JNK1/2通路的激活。