背景:胰腺恶性肿瘤是消化系统恶性肿瘤中恶性程度最高的一种恶性肿瘤,诊断和治疗困难。源自导管腺上皮的导管腺癌占约90%,近年来其发病率和死亡率显着增加。5年生存率极低,是最严重的恶性肿瘤之一。胰腺癌的早期诊断率不高,手术死亡率高,治愈率很低。胰腺癌恶性程度高,手术切除率低,预后差。尽管手术仍然是主要治疗方法,但胰腺癌常因为发现较晚,错失了根治的机会,因此需要综合治疗胰腺癌。迄今为止,与大多数肿瘤一样,目前诊断胰腺癌的综合治疗仍以手术治疗为基础,辅以放疗和化疗。可以对不能手术切除的胰腺癌,或者为了预防胰腺癌术后复发进行化疗。胰腺癌化疗有望降低术后癌症复发和转移的发生率,而化疗失败的主要表现即为胰腺癌出现复发及转移的情况。肿瘤形成、发生发展、以及后续治疗后复发的病生病理过程中,糖酵解和耐药的关系十分密切,吉西他滨（Gemcitabine）在胰腺癌的化疗中具有无可替代的地位和作用,而吉西他滨耐药发生发展的过程中,糖酵解效用会呈现出明显的增强效果。在正常细胞中,葡萄糖保持平衡状态。在没有氧气的情况下,葡萄糖转化为丙酮酸并变成乳酸。当氧含量正常时,丙酮酸进入三羧酸（TCA）循环。肿瘤细胞的一个共同特征是,即使在正常氧水平的情况下,葡萄糖摄取量和乳酸积累量也会逐渐增加,这种现象我们称之为Warburg效应。近年来,人们一直试图通过抑制肿瘤糖酵解途径中关键酶的活性来靶向治疗恶性肿瘤。人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）是胰岛β细胞中形成的一种激素,其本身在调节糖代谢中具有生理作用,并和胰岛素按照固定比例共存于胰岛素分泌颗粒之中。2005年3月,FDA批准普兰林肽（Pramlintide,一种合成的淀粉样肽）用于辅助治疗糖尿病。最近由nature发表的一项研究表明,hIAPP或普兰林肽经CalR和RAMP3通道进入细胞内,并通过抑制己糖激酶进而减少G-6-P的形成,这一结果表明hIAPP和糖酵解具有十分密切的关系,hIAPP对抑制糖酵解具有重要的作用。而其与吉西他滨耐药的关系尚未见任何报道,因此,本研究希望通过使用外源性hIAPP抑制糖酵解进而改善胰腺癌吉西他滨耐药,为胰腺癌的治疗提供又一个全新的研究思路。方法:1、通过吉西他滨对人胰腺癌细胞系PANC-1细胞进行培养,建立具有吉西他滨耐药性的细胞株Gem-R,通过浓度梯度方式及MTS实验测定IC50,直至浓度增至10倍的IC50（即316n M）,后续定期使用吉西他滨（316n M）刺激Gem-R细胞,以保持其耐药性。药物诱导后将Gem-R细胞置于不含吉西他滨的培养液中培养2周后,用于实验。通过慢病毒稳定转染Gem-R,使得具有嘌呤霉素抗性的新细胞系得以建立,之后使用2μg/ml嘌呤霉素进行筛选。筛选稳定表达hIAPP的细胞系hIAPP-Gem-R1和对照细胞系CON-Gem-R。通过q RT-PCR检测hIAPP-Gem-R细胞和CON-Gem-R细胞中hIAPP基因m RNA的表达。硫代硫黄素S染色hIAPP-Gem-R细胞以及CON-Gem-R细胞后,利用倒置的荧光显微镜检测其中hIAPP表达情况;硫代硫黄素S染色hIAPP-Gem-R细胞以及CON-Gem-R细胞后,利用化学发光仪检测其中hIAPP表达所造成的荧光强度;利用MTS法检测hIAPP-Gem-R细胞以及CON-Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下的增殖能力增殖率,通过克隆形成实验法检测hIAPP-Gem-R细胞以及CON-Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下的增殖能力;利用Annexin V-FITC/PI法检测hIAPP-Gem-R细胞以及CON-Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下的凋亡情况。2、利用已经构建成功的吉西他滨耐药性的细胞株Gem-R,使用普兰林肽（10mg/L）浓度对吉西他滨耐药性的细胞株Gem-R进行培养,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,使用普兰林肽（10mg/L）与不使用普兰林肽的效果差异,以明确普兰林肽是否可以改善胰腺癌吉西他滨化疗耐药。利用克隆形成实验,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,使用普兰林肽（10mg/L）与不使用普兰林肽对增殖能力的影响;利用EdU实验,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,使用普兰林肽（10mg/L）与不使用普兰林肽对增殖的影响;利用Annexin V-FITC/PI法,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,使用普兰林肽（10mg/L）与不使用普兰林肽对凋亡情况的影响。3、通过Western blot方法检测转染CalR-siRNA质粒或RAMP3-siRNA质粒后吉西他滨耐药性的细胞株Gem-R的CalR或RAMP3蛋白的表达情况。使用普兰林肽（10mg/L）浓度对吉西他滨耐药性的细胞株Gem-R进行培养,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,CalR或RAMP3蛋白被抑制或不被抑制时的效果差异,以明确普兰林肽是否为通过CalR或RAMP3蛋白进入细胞这一机制来改善胰腺癌吉西他滨化疗耐药的。利用克隆形成实验,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,CalR或RAMP3蛋白被抑制或不被抑制时,普兰林肽是否为通过CalR或RAMP3蛋白进入细胞这一机制来改善胰腺癌吉西他滨化疗耐药;利用Annexin V-FITC/PI法,检测Gem-R细胞在吉西他滨1μM条件下,CalR或RAMP3蛋白被抑制或不被抑制时,普兰林肽是否为通过CalR或RAMP3蛋白进入细胞这一机制来改善胰腺癌吉西他滨化疗耐药;结果:1、使用吉西他滨0.01μM开始,培养PANC-1细胞,以20n M为单位梯度增加吉西他滨浓度,直至10倍的IC50（图1-1A,B）浓度316n M时,吉西他滨培养细胞无死亡,建立具有吉西他滨耐药的Gem-R-PANC-1细胞系,培养周期6个月。Western Blot法检测P-gp蛋白,发现耐药株P-gp蛋白显著表达,而野生型PANC-1细胞P-gp基本无表达。通过慢病毒稳定转染Gem-R,使得具有嘌呤霉素抗性的新细胞系得以建立,之后使用2μg/ml嘌呤霉素进行筛选,经过2周的筛选成功建立。通过硫代硫黄素S染色,hIAPP-Gem-R细胞与CON-Gem-R细胞相比,其荧光强度显著增强。采用q RT-PCR检测hIAPP在CON-Gem-R细胞和hIAPP-Gem-R细胞中的表达。结果表明,hIAPP-Gem-R细胞中hIAPP的表达明显高于CON-Gem-R细胞。MTS法测定各组细胞增殖活性,可见过表达hIAPP耐药细胞株细胞增殖活性显著下降,过表达hIAPP可以明显改善耐药情况。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡法测定可见过表达hIAPP耐药细胞株细胞凋亡显著增多,过表达hIAPP可以改善耐药情况。克隆形成实验测定各组细胞增殖活性,可见过表达hIAPP耐药细胞株细胞增殖能力显著下降,过表达hIAPP可以改善耐药情况。2、以吉西他滨（1μM）加普兰林肽（10mg/L）或单独吉西他滨（1μM）分别对耐药株细胞培养14天,克隆形成法测定各组细胞增殖情况,可见普兰林肽（10mg/L）组耐药细胞株细胞增殖能力显著下调,普兰林肽可以改善耐药情况。克隆形成实验检测外源性hIAPP（普兰林肽）对胰腺癌耐药细胞株增殖能力的抑制。以吉西他滨（1μM）加普兰林肽（10mg/L）或单独吉西他滨（1μM）分别对耐药株细胞培养,EdU法测定各组细胞增殖情况,可见普兰林肽（10mg/L）组耐药细胞株细胞增殖能力显著下调,普兰林肽可以改善耐药情况。以吉西他滨（1μM）加普兰林肽（10mg/L）或单独吉西他滨（1μM）分别对耐药株细胞培养,Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡法测定各组细胞凋亡情况,可见普兰林肽（10mg/L）组耐药细胞株细胞凋亡显著上升,外源性hIAPP（普兰林肽）可以改善耐药情况。3、对Gem-R细胞使用CalR-siRNA及RAMP3-siRNA后,通过Western Blot法检测CalR或RAMP3表达情况,发现二者表达均受到了一定程度的抑制。对Gem-R细胞使用CalR-siRNA或RAMP3-siRNA后,以吉西他滨（1μM）加普兰林肽（10mg/L）分别对耐药株细胞组和siRNA转染组培养,Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡法可见siRNA转染组凋亡率明显下降。对Gem-R细胞使用CalR-siRNA或RAMP3-siRNA后,以吉西他滨（1μM）加普兰林肽（10mg/L）分别对耐药株细胞组和siRNA转染组培养,克隆形成实验测定各组细胞增殖情况,可见siRNA转染组增殖能力较对照组有所升高。结论:吉西他滨耐药模型Gem-R已经成功建立。过表达hIAPP的hIAPP-Gem-R细胞系已成功建立,hIAPP-Gem-R细胞模型的在吉西他滨1μM浓度下,其增殖能力显著下降,其凋亡情况有所恢复,验证了hIAPP对改善胰腺癌吉西他滨耐药具有重要的意义和作用。在吉西他滨1μM浓度下,普兰林肽（10mg/L）条件下培养的吉西他滨耐药型细胞的相比无的耐药细胞,其增殖能力显著下降,其凋亡情况有所恢复,验证了普兰林肽对改善胰腺癌吉西他滨耐药具有重要的意义和作用;在吉西他滨1μM浓度,普兰林肽（10mg/L）条件下培养的吉西他滨耐药型细胞,如果CalR或RAMP3受到抑制后,其增殖能力有所恢复,其凋亡有所减少,说明了普兰林肽这一外源性hIAPP是通过CalR或RAMP3进入胰腺癌细胞体内来改善胰腺癌吉西他滨耐药的。