目的:δ-catenin由CTNND2基因编码,是一种E钙粘蛋白（E-cadherin）相关蛋白,属连环蛋白δ亚家族的一员。δ-catenin最初被鉴定为富集在脑组织中,但与该家族另一成员p120ctn一样,δ-catenin包含10个armadillo重复单元并且可与保守的E-cadherin的近膜结构域（JMD,juxtamembrane domain）结合以维持E-cadherin稳定性。已有文献表明δ-catenin与一些癌症有关。δ-catenin通过与E-cadherin的JMD结合可以促进非小细胞肺癌的恶性表型。也有研究指出,δ-catenin的异位过表达与前列腺癌的进展有关。还有报告称,δ-catenin引起细胞周期和基因谱的改变。另外,δ-catenin可以诱导E-cadherin加工,激活β-catenin介导的致癌信号的机制。然而,δ-catenin在肾癌发生发展中的确切作用尚不清楚,其表达与肾癌的临床病理参数存在怎样的关系也不清楚。这些问题需要深入探索。肾细胞癌（RCC,renal cell carcinoma）约占所有肾癌病例的90%。早期检测技术的进步虽然提高了RCC的生存率,但治疗后的局部进展、远处转移和对放化疗不敏感仍然是其预后不良的主要因素。因此,针对RCC分子机制的研究将有助于发现新的有效抗癌药物和新的诊断标志物。除HGF/Met、PI3K/Akt/m TOR和VHL/缺氧细胞信号通路外,有关Wnt/β-catenin通路参与RCC的研究也较为普遍。已知Wnt信号通路及其靶基因积极参与胚胎发育和肾癌的不同生物学过程。研究表明,靶向抑制该通路的细胞内信号转导可以降低癌细胞活力并抑制其生长。有文献显示,前列腺癌中δ-catenin的异常高表达可以促进肿瘤进展,而且δ-catenin可以影响β-catenin的亚细胞分布进而调节其下游靶基因的表达。因此我们推测,δ-catenin与RCC之间可能存在联系。本研究通过Western blot和免疫组化染色方法检测RCC组织标本中δ-catenin的表达情况,并分析其表达与临床病理因素的相关性。本研究在分析了δ-catenin与RCC细胞的增殖和凋亡的关系之后,探讨了δ-catenin对β-catenin和β-catenin介导的致癌信号的调控以及在异种移植小鼠模型中δ-catenin对肿瘤生长的影响。这种对δ-catenin的重新认识可能有助于建立一种新的靶向治疗方法,以及发现RCC新的诊断标记物。研究方法:1、免疫组织化学染色。载玻片加热,二甲苯脱蜡,分级乙醇水化。抗原修复后,山羊血清封闭组织切片。然后切片在4℃下暴露于抗δ-catenin或Ki67抗体过夜。PBS冲洗切片,以HRP标记的羊抗兔抗体孵育1小时。洗片后加入二氨基联苯胺（DAB）,苏木精反染。最后将切片用分级乙醇脱水,用中性香脂密封,在400倍显微镜下观察。2、免疫蛋白印迹。RIPA裂解液裂解收集的细胞。BCA蛋白检测试剂盒评估蛋白浓度。蛋白质裂解产物经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到PVDF膜上,与一抗在4℃下孵育一夜,然后与山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG在37℃下孵育。用增强化学发光法（ECL）观察蛋白带。采用凝胶图象处理系统Gel-Pro-Analyzer软件分析目标条带光密度值。3、细胞培养。人肾上皮细胞系HK-2和人肾癌细胞系A498、ACHN和786-O购至武汉普诺赛生命科技有限公司。HK-2、A-498和ACHN均用含10%胎牛血清的MEM培养基于37℃、5%CO2的培养箱内培养。786-O用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于同样条件下培养。4、细胞核和细胞质蛋白提取。细胞于裂解缓冲液A中溶解后加入PMSF冰浴。加入细胞质裂解缓冲液B。混合液短暂震荡后于4℃,12000g离心机中离心5分钟。上清即为细胞质提取物。核裂解缓冲液重悬附壁物,冰中保存30分钟,并保证期间数次短暂震荡。然后于4℃,12000g离心10分钟,上清为核提取液。BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。5、质粒的构建以及和siRNA的转染。在NCBI中找到δ-catenin的相应序列,设计退火引物.利用质粒大量制备试剂盒提取质粒（pRNAH1.1载体）。连接退火引物与质粒。按照转染流程,将δ-catenin siRNA或NC siRNA加脂质体2000导入到A498和ACHN细胞中。将δ-catenin sh RNA质粒转染到ACHN细胞系用以沉默δ-catenin,并以NC sh RNA作为阴性对照。6、RNA提取和实时定量PCR（qRT-PCR）。根据流程,使用总RNA快速提取试剂盒分离RCC细胞中的RNA。应用M-MLV反转录酶将这些RNA反转录成c DNA。采用Taq HS Perfect Mix和SYBR Green试剂盒进行实时定量PCR。数据荧光定量仪进行分析。7、CCK-8测定。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。将RCC细胞预先接种到96孔板中,每孔4×103。粘附后,用NC siRNA和δ-catenin siRNA转染细胞;将CCK-8试剂加入96孔板中,每孔10μl,孵育1小时。用酶标仪在450 nm处分别测量0、24、48、72、96小时光密度（OD）值。8、免疫荧光检测。细胞爬片用4%多聚甲醛固定,0.1%triton X-100渗透。样品用山羊血清处理后,将一抗（Ki67和βcatenin）加入细胞中,4℃孵育过夜。PBS洗涤后,用稀释的Cy3标记的山羊抗兔IgG滴加入样品并于室温孵育。DAPI对细胞核进行复染后密封样品。最后,在400倍的荧光显微镜下观察。9、流式细胞术。按照用细胞周期分析试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒的流程处理细胞,应用Novo Cyte流式细胞仪检测RCC细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。10、双荧光素酶分析。在ACHN细胞中导入δ-catenin siRNA。再应用萤火虫荧光素酶报告质粒TOPflash/FOPflash和编码海肾荧光素酶的载体进行转染。依照流程,应用双荧光素酶报告基因测定法检测荧光素酶活性。11、动物实验。本研究的动物实验均经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准,并按照《实验动物护理与使用指南》进行。6周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为2组,每组6只。将δcatenin sh RNA质粒,或NC sh RNA质粒转染的ACHN细胞注射到裸鼠右侧腋窝皮下。每4天测量一次肿瘤大小,肿瘤体积:V=（宽2×长）/2。注射后27天处死小鼠。切除肿瘤,记录肿瘤重量。结果:1、δ-catenin在人肾癌组织中有高表达,其高表达与p TNM分期、肿瘤分级和淋巴结转移有关。2、δ-catenin在人肾癌细胞中有高表达。3、δ-catenin可促进肾癌细胞增殖。4、δ-catenin可抑制肾癌细胞凋亡。5、δ-catenin能影响肾癌细胞中β-catenin的核定位及其下游靶基因表达。6、在ACHN异种移植小鼠模型中δ-catenin能促进肿瘤的生长。结论:1、δ-catenin在人肾癌组织中高表达,其高表达与RCC患者预后不良有关。2、δ-catenin在肾癌细胞中有高表达,可促进肾癌细胞增殖及抑制细胞凋亡。3、在肾癌细胞及ACHN异种移植小鼠模型中,δ-catenin能够对β-catenin的核定位及其下游靶基因的表达产生影响。