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植物microRNA (miRNA)是一种植物内源产生的非编码RNA,通过对其靶基因表达进行转录后负调控,从而参与植物的生长发育过程。花粉发育是种子植物有性生殖的一个重要环节。有报道多个niRNA 可能参与花粉发育过程。在前期的研究中,本实验室以一对隐性基因控制的白菜核不育两用系’Bcajh97-01A/B’为材料,对花粉发育相关miRNA进行了高通量测序,鉴定到miR158在不育株和可育株中差异表达明显,并发现过表达白菜mi 158可引起花粉发育异常。在本文中,我们继续对白菜mi158在花粉发育过程中的功能进行研究。首先克隆了白菜miR158的两个前体基因及其靶基因Bra027656,随后利用qRT-PCR和启动子-GUS报告系统分析了白菜miR158两个前体基因的时空表达模式,最后通过观察过表达和抑制表达白菜miR158引起的转基因植株表型差异,对白菜miR158及其靶基因的功能和可能的作用模式进行了初步的研究。获得的主要结果和结论如下：(1)以预测得出的白菜miR158的两个前体发卡序列为依据设计引物,克隆获得白菜miR158的两个前体基因。这两个前体基因分别位于5号和8号染色体,其转录产物能够形成稳定的二级结构,同时在niRNA 和 miRNA*区域高度保守,这符合miRNA的进化特征,也暗示了miRl58功能的保守性。共线性分析结果表明这两个前体基因所在的基因组区域能够对应到拟南芥miR158a所在的区域,系原始的Ath-miR158a伴随芸薹属基因组三倍化后保留的产物,因此我们将其分别命名为Bra-miR158a1 和 Bra-miR158a2。(2)利用RACE技术分析明确了白菜miR158的靶基因Bra027656的5’和3’cDNA序列,并据此设计引物克隆获得该基因。其DNA序列全长2175 bp,由两个外显子和一个内含子组成,ORF全长2046 bp,编码一个由682个氨基酸组成的PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白。通过BLAST搜索,发现Bra027656氨基酸序列与萝卜的细胞质雄性不育系育性恢复相关PPR-B蛋白氨基酸序列高度相似。这暗示了Bra027656可能与PPR-B具有相同的作用模式。(3) qRT-PCR分析结果表明pre-Bra-miR158a1 和 pre-Bra-miR158a2的表达存在时空差异。虽然两者均在花序中有较高的表达量,但前者的相对表达量高于后者,尤其是在第三级花蕾时期(单核花粉粒时期),启动子-GUS报告系统分析Bra-miR158a1 和 Bra-miR158a2的启动子活性也获得了相似的结果。据此,我们认为白菜miR158可能在花粉发育的单核花粉粒至双核花粉粒时期发挥作用,而且pre-Bra-miR 158a1对miRl58的合成起主效作用。通过序列比对,发现pre-Bra-miR158a1 和 pre-Bra-miR158a2启动子序列存在较大的差异,推测两者差异的时空表达模式可能是由启动子序列的差异引起。(4)构建抑制表达Bra-miR158载体,连同前期已构建好的过表达Bra-miR158载体转化‘油青四九’菜心。通过对获得的转基因植株进行细胞学和形态学观察,发现过表达Bra-mi R158转基因植株药室中约25%的花粉丧失活力,无活力花粉的异常发育始于单核小孢子时期,花粉内含物降解,花粉皱缩或空泡化。结合Bra-miR158的时空表达模式,这说明白菜miR158对花粉的形成具有重要作用。然而,抑制表达Bra-miR158转基因植株生长发育并未出现异常,这说明存在白菜miRl58靶因的下游基因对靶基因的缺失不敏感或者不产生任何反应的可能。我们推测白菜miR158的靶基因可能通过作用于小孢子线粒体内某些重要的代谢途径基因而参与花粉发育,这些基因的异常表达会引起小孢子内含物的代谢发生紊乱,导致内含物降解,进而间接影响花粉内壁物质的合成,导致花粉皱缩、塌陷或空泡化。