论文部分内容阅读
马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)是我国重要的人工海水育珠贝。海水珍珠培育的最核心环节是植核育珠技术:即将珠核和细胞小片(来源于供体贝)移植到受体贝的内脏团,受体贝组织和细胞小片共同形成珍珠囊,分泌珍珠质形成珍珠。植入的珠核和细胞小片在受体贝体内会引起免疫排斥反应,可能会导致受体贝排出植入的珠核,甚至死亡。因此,长期以来,科研人员及养殖者都积极采取各种措施以试图降低植核育珠中的免疫排斥反应,但到目前为止,未能解决此类问题,其根本原因是机体针对植核育珠应激的免疫应答关键因子尚未明了。本研究以马氏珠母贝为研究对象,通过植核育珠手术培育珍珠,以植核后不同时期马氏珠母贝血淋巴细胞为研究材料,通过RNA高通量测序(RNA-seq)技术构建转录组文库,并对其进行测序、组装和生物信息学分析,分析免疫相关基因的差异表达并筛选关键信号通路,确定参与此过程的差异表达基因;同时运用同位素相对与绝对定量(iTRAQ)技术与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术联用,对植核后不同时期的血细胞总蛋白质进行了定量分析,筛选植核育珠过程中的免疫相关蛋白质。结果如下:利用转录组测序得到植核育珠过程中7个不同时期的血细胞转录组文库,合并为1个转录组文本集,共得到81,390个unigene,预测到的CDS共有36,604个。注释到NR、Swiss-Prot、COG和GO库的unigene分别有31,689个、25,253个、12,065个和12,720个。其中COG分类中有1,636个unigene的功能是未知的。大约有21,811个unigene可能参与302个已知的代谢通路。与植核前相比,植核育珠后5天、10天、15天、20天、30天和60天分别有3,345、6,846、4,636、4,167、4,716和6,679个差异表达基因,且在植核育珠后第10天差异表达基因数目最多。从植核育珠后不同时期差异表达基因中筛选出的46个免疫相关基因,分别编码溶菌酶、清道夫受体、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、甘露糖受体、凝集素和Toll样受体等蛋白。在不同时期的差异表达基因的KEGG富集结果中都发现细胞粘附分子(cell adhesion molecules)通路和原发性免疫缺陷(primary immunodeficiencies)通路被显著性富集(P<0.05)。利用iTRAQ技术并结合LC-MS/MS,对马氏珠母贝植核前、植核育珠后10天、20天和30天的血细胞总蛋白质进行了相对与绝对定量分析,共采集到277,226张二级质谱图,鉴定到的肽段数目为43,421条,获得的蛋白质有2,702个。与植核前相比,植核育珠后10天、20天和30天的血细胞中分别有97、103和101种显著差异蛋白。10天与植核前相比,有37个上调蛋白、60个下调蛋白;20天与10天相比,得到29个差异蛋白,其中21个上调,8个下调;30天与20天相比,有12个上调差异蛋白、9个下调差异蛋白。获得的免疫相关的差异蛋白质有原钙黏蛋白(Protocadherin)、血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)、细胞凋亡蛋白酶(caspase)、干扰素诱导蛋白、白介素17受体、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子相关因子、热休克蛋白70、TRIM家族蛋白、TNF-α诱导蛋白、Notch家族蛋白、抗菌L-氨基酸氧化酶、E3泛素连接酶、整合素、死亡相关蛋白激酶、肽聚糖识别蛋白等。本研究分别从转录组和蛋白质组两个方面研究了马氏珠母贝植核育珠后不同时期血淋巴中与免疫相关的差异表达基因和蛋白质,不仅丰富了马氏珠母贝的cDNA和蛋白质数据,而且为进一步了解育珠过程中机体免疫的变化规律及揭示马氏珠母贝耐受移植的分子机制奠定基础,进而更加深入探究无脊椎动物非特异性免疫相关机制。