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日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decarpoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(Penaeidae)、囊对虾属(Marsupenaeusl)。广泛分布于印度.西太平洋,是重要的经济物种。甲壳动物视神经节对蜕皮、生殖、体色等具有调控作用,是重要的神经内分泌中心。本研究对日本囊对虾视神经节的体外培养、电压门控型钠离子通道的电生理特征,以及钠离子通道的分子克隆等进行了研究。主要结果包括以下内容:
1.组织学研究结果表明,日本囊对虾视神经节由视神经层、视外髓、视内髓和视端髓组成。根据神经细胞的形态、细胞核和细胞质的特征,可以分为6种类型,分布于5个细胞群中。
2.Nav1.5型钠离子通道抗体的阳性反应零星分布于视外髓前端附近、视内髓与视端髓之间,以及视端髓外侧的3个细胞群中:阳性反应出现主要位于Ⅱ和Ⅲ型细胞的细胞核。推测日本囊对虾视神经节Ⅱ和Ⅲ型细胞核膜上可能存在Nav1.5离子通道类似蛋白。
3.在25℃下,通过加入20％FBS的M199或L-15对视神经节进行组织与细胞培养。视神经节体外组织培养可存活15天以上。通过木瓜蛋白酶或胶原酶酶解的细胞在体外存活7-14天。在细胞密集的环境中,细胞突起交联在一起,在第5天时贴壁并且长出轴突的细胞数量达到最大。根据细胞突起的数量及形态将细胞分为5类:多极细胞、单极细胞、双极细胞、成膜细胞和大型细胞。其中双极细胞又可分为3种形态。研究发现,存活能力最强的细胞为纺锤形双极细胞,在所有培养基中均能存活,存活时间可到14天以上。
4.本实验采用木瓜蛋白酶消化和机械吹打相结合的方法,急性分离视神经节X器官的细胞,选用30-40岬的细胞进行检测,细胞平均电容为27.5 pF。全细胞电流观察到刺激电压之后产生一个较大的内向电流,之后伴随着一个较小的外向电流。在钙离子与钾离子抑制剂存在的情况下,观察到一快速内向电流。在-80至+60 mV的阶梯去极化脉冲刺激中,内向电流在-50 mV时开始出现并逐渐增大;当达到-10 mV时,电流达到峰值,峰值平均大小为2975±234.5 pA。该电流受外界钠离子浓度的影响,且与Nernst方程所计算的钠离子反转电位相近,从而进一步断定为钠离子通道电流,且为电压门控型钠离子通道电流。
5.钠离子通道分为河豚毒素(Tetrodoxin,TTX)敏感型与不敏感型。本实验通过改变细胞外液中TTX浓度,观察TTX对视神经节钠离子通道电流峰值的影响;同时通过双脉冲刺激的方法来观察TTX对钠离子通道激活与失活的影响。钠离子通道电流大小受到TTX的影响,其数据可用Hill方程拟合,半抑制浓度(Halfmaximal inhibitory concentration,IC50)值为2.1±0.1 nM。用正常生理溶液洗脱TTX影响下的细胞,钠离子通道电流会逐渐恢复到正常大小。在TTX存在情况下,半激活电压为-19.3-±0.5 mV;TTX不存在的情况下,半激活电压为-20.6±0.5 mV,TTX不影响钠离子通道电流半激活电压的大小。此外,TTX的存在与否也不影响钠离子通道的激活与失活。
6.电压门控型钠离子通道(Voltage-gate sodium channel,VGSC)的分子克隆。获得日本囊对虾VGSC蛋白的部分cDNA序列,该片段核苷酸长度为2877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子量约为108.2 kD。与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其它一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性。基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树能够反映出各物种间的进化关系。该片段包含一个钠离子通道特征序列(Na_trans_assoc)以及与其相关的DUF3451序列,还有两个位于钠离子通道特征序列两端的跨膜结构区(Ion trans)。在跨膜结构区的第四个跨膜结构上均有一个带正电的氨基酸和两个非极性氨基酸重复4-5次所构成的电压感受器结构。
7.根据已获得的cDNA片段为基础设计引物,以β-actin为内参,分别检测了对虾的6个组织器官(肌肉、肝胰腺、心脏、视神经节、脑神经节、胸神经节)中VGSC的mRNA转录表达情况。VGSC mRNA表达量最高的是脑神经节,接近于β-actin基因表达量,其次为肝胰腺,在血淋巴中检测不到VGSC mRNA的表达。此结果显示VGSC的分布呈现出组织特异性。