论文部分内容阅读
H9N2亚型禽流感（AI）持续在我国鸡群中广泛流行,不仅可以感染禽类,还可以感染哺乳动物以及人类,为了明确山东及周边养殖场H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子进化情况及其致病性,本研究在2016年2019年间从山东及周边养殖场病鸡、病鸭等分离鉴定出37株H9N2 AIV,经病毒纯化后,将病毒各基因片段进行RT-PCR扩增和克隆测序,获得各分离株全基因组序列,并进行遗传演化和重要的氨基酸位点的变异分析。结果显示:37株H9N2 AIV 8个基因片段均属于欧亚谱系,但8个基因片段的分子进化关系呈现出基因多样性:37株HA和NA基因来自Y280-like;HA基因之间的核苷酸同源性为92.2%99.9%,NA基因之间的核苷酸同源性为90.6%99.9%;M、NS基因来自G1-like;PA、NP、PB1基因来自F98-like;PB2基因来自G9-like。HA蛋白的受体结合位点149、198、234和235位点变异最多,37株分离株HA第234位氨基酸（相当于H3第226位氨基酸）全部由Q突变为L,235位点全部突变为M,32株分离株在HA蛋白218300位糖基化位点缺失,所有分离株均在313315位出现潜在的糖基化位点;仅3株分离株的NA蛋白399位出现糖基化位点,而在264位有13株分离株出现了新的潜在糖基化位点,所有分离株NA蛋白颈部的63-65位氨基酸缺失;6株分离株在PB2蛋白的627位点发生变异,1株在714位点发生变异。选取HA基因进化距离较远和核苷酸同源性差异较大的12株H9N2 AIV进行抗原性分析,结果发现H9N2 AIV之间的交叉HI和R值存在差异,部分毒株抗原性存在差异显著。以上结果表明,近四年山东周边地区流行的H9N2 AIV是由不同进化方式而来,部分重要氨基酸位点和抗原性发生变异,具有潜在感染哺乳动物的可能性,因此需加强H9N2 AIV的分离鉴定,密切监测其遗传变异。基于对HA基因进化树和核苷酸同源性的分析,选取HA基因进化树距离较远和核苷酸同源性差异较大的代表毒株进行生物学活性测定,研究不同年代分离株SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性和致病性。结果显示2016年2019年间H9N2 AIV代表株对SPF鸡胚的适应性较好,EID50数值在106109.25之间;在MDCK细胞上测定的TCID50值在100.75109之间,差异比较显著;所有代表株都能在鸡体进行复制并排毒,但病毒滴度较低;21株代表毒株中19株病毒不经适应就能在小鼠肺脏进行复制,并且大部分毒株的病毒滴度较高并引起明显的病理损伤和体重下降。结果表明近四年H9N2 AIV分离株在哺乳动物细胞和体内的复制能力存在差异,且对小鼠肺脏的感染能力相对于鸡肺脏的感染能力呈现一定上升趋势。因此,应重视家禽中H9N2 AIV的监测及其对哺乳动物致病性的变化,为低致病性AIV跨物种感染哺乳动物提供预警。为解析H9N2 AIV对哺乳动物感染能力增强的分子机制,本试验通过以上持续流行病学调查,结合生物信息学技术,筛选可能增强AIV感染哺乳动物的关键HA氨基酸突变位点,进一步利用H9N2 AIV反向遗传平台进行HA基因点突变,构建突变病毒,测定其生物学特性并鉴定HA互作差异宿主蛋白。本研究成功构建9株突变病毒,其中突变株CK/SD/903（N313Q）、CK/SD/903（T198I）、CK/SD/903（M235Q）、CK/SD/903（M235R）的TCID50值较野毒株略有增加,H9N2 AIV缺失HA蛋白218位糖基化位点后降低其在哺乳动物细胞中的感染能力。野毒株CK/SD/903和突变株CK/SD/903（N218Q）的HA蛋白共有互作宿主蛋白有27个,这些蛋白主要参与Anti gene processing and presentation、Ribosome、Spliceosome等信号通路,差异互作蛋白参与Antigen processing and presentation、Protein processing in endoplasmic reticμLum、Pathogenic Escherichia coli infection等通路。结果表明,H9N2 AIV病毒HA蛋白218位糖基化、Thr198和Met235位点的某种氨基酸突变能够提高病毒在哺乳动物细胞上的增殖,HA蛋白218位糖基化位点可能通过影响病原感染、抗原提呈、病毒蛋白合成等过程增强病毒对哺乳动物细胞的感染性。本试验结果为H9N2 AIV适应哺乳动物并引起致病的研究提供新的视角,为进一步探索H9N2 AIV跨物种感染机制奠定基础。