斑马鱼中的遗传学研究帮助我们深入了解脊椎动物保守基因的功能。多种诱变基因的方法在斑马鱼中得到应用。我们利用假型反转录病毒感染斑马鱼的胚胎，通过病毒的插入诱变斑马鱼的基因，并在F1代对整合位点进行定位，同时冷冻保存F1鱼系的精子。本论文共获得了933个前病毒序列整合位点，其中599（64％）个在Ensembl斑马鱼基因组数据库Zv6中能够定位到染色体或基因组片段上，233（39％）个定位于基因内部。前病毒整合位点在各染色体上的分布基本平均；但相对于基因的位置则强烈偏好于基因的转录起始位点上游和第一个内含子：20％的整合位点位于基因上游3kb以内的区域，而在233个定位于基因内部的插入中，有59％位于第一个内含子中。对28个不同的genehit进行mRNA水平的分析，结果显示有50％的基因插入能够在mRNA水平上造成70％以上的降低，其中位于外显子或第一个内含子的插入更易于造成RNA水平的降低。上述结果表明，对于所有能够在基因组上定位的整合位点，有20-30％可以对基因在mRNA水平上造成70％以上的破坏。这和目前所常用的TILING方法相比，提高了20-30倍的突变效率。反转录病毒诱变基因的高效率结合斑马鱼全基因组测序基本完成和新的测序策略的应用，使我们以较低的投入建立斑马鱼全基因组范围内的反转录病毒饱和诱变库成为可能。　　 完成上述项目后，我在NIH开始另一个新的课题，socs3基因在斑马鱼侧线神经丘发育和再生中的功能研究。斑马鱼的侧线系统是由多个分布于鱼体表面的神经丘组成的感觉神经系统。神经丘的形成过程涉及到前体的形成、组织、迁移、停落和毛细胞的分化发生等过程。我们研究了socs3基因在此过程中的作用。在哺乳动物中，Socs3是作用于免疫系统中cytokine信号通路的一种负反馈抑制因子，通过作用于cytokine受体或直接结合Stat3来抑制Stat3的磷酸化激活，从而调控下游基因如TGFβ的表达。　　 在斑马鱼中，Socs3具有保守的蛋白结构域--SH2结构域和SOCS盒。我们克隆了socs3基因的cDNA，通过原位杂交显示，socs3在斑马鱼胚胎发育早期的后端侧线（PLL）前体以及形成的侧线神经丘中特异表达。为研究socs3在PLL发育中的功能，我们设计了抑制翻译的对socs3特异的morpholino敲低socs3的表达。在2dpf的胚胎中，PLL共形成5-6个神经丘，但在socs3被敲低的morphant中，平均只有2个神经丘（neuromast）形成。对在PLL前体特异性表达的marker基因cxcr4和cdh2进行原位杂交，结果显示，野生型胚胎中，迁移过程中的前体细胞团形成3个玫瑰花形结构，玫瑰花形结构中心染色较深，其后缘的玫瑰花形结构将要停落为前神经丘：但在morphant中，前体细胞团体积变小，细胞也更紧密，只分成两组细胞，但没有中心染色较深的玫瑰花形结构。特异性标记前感觉神经中心点（prosensory foci）的ath1基因原位杂交结果显示，相对于野生型前体的三个前感觉神经中心点，morphant中只有两个，而且较小，缺少最前缘负责更新的细胞组。两条不同靶向位点的socs3特异的morphorlino导致同样的表型，暗示对PLL前体的影响是特异性的作用。因此，我们认为PLL前体细胞团的结构和在迁移过程中的更新需要socs3的参与；如果缺失socs3，PLL前体虽然能够迁移到目的地，但由于缺少玫瑰花形结构的形成和更新，只能停落少量的前神经丘。　　 同时，我们观察了socs3对毛细胞发生的作用。3dpf时，在morphant所形成的神经丘中，相对于野生型胚胎，毛细胞的数量大为减少，暗示socs3和毛细胞的发生有关。检测ath1在2dpf胚胎中的表达，发现它在morphant单个神经丘中的表达量增加。我们推测缺失socs3的表达，很可能影响了支持细胞向毛细胞的分化，或者影响了毛细胞的成熟，或者二者皆有影响。　　 我们检测了socs3的morphant中cytokine信号通路下游基因的表达。stat3和tgfb1都是在侧线系统中表达的基因，RT-PCR结果显示二者表达水平都有所增加，socs3基因本身的表达量也大大提高。可见，socs3在斑马鱼侧线系统中的作用机制是非常保守的，同样参与Stat3和Tgfb1信号通路，采用负反馈抑制的作用机制，这一机制有可能是socs3调控PLL前体的结构和停落以及毛细胞分化成熟的分子机制。　　 FGF信号通路在斑马鱼PLL前体的组织结构和迁移停落前神经丘等过程中有着至关重要的作用。用su5402抑制FGF信号通路后，socs3的表达水平并没有变化；socs3的morphant中，fgf3和fgf10的表达没有变化，fgfr1则有少量的增加，暗示socs3有可能通过调控.fgfr1的表达和FGF信号通路关联。　　 socs3是在筛选内耳毛细胞再生相关的基因时得到的候选基因，所以我们还研究了socs3在侧线系统的毛细胞再生过程中的作用。结果显示，socs3的缺失对毛细胞的再生没有影响。