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前言 原发性肾病综合征(PNS)是小儿常见肾脏病之一，其发病机制尚不十分清楚，目前已有研究表明白细胞介素8(IL-8)基因和蛋白表达增强可能参与了蛋白尿形成。 IL-8是炎症性细胞因子中活性最强的一种，正常人体外周血中含有极微量的IL-8。Garin等通过动物实验提出IL-8可以诱发蛋白尿，可能是通过影响肾小球基底膜(GBM)硫化物的代谢，改变阴电荷屏障而造成GBM对血浆蛋白通透性增高的结果。甲基强的松龙冲击治疗原发性肾病综合征与常规口服强的松治疗相比达缓解时间短、副作用少，有关激素冲击治疗前后较短时间内IL-8血清学及基因表达的变化尚未见报道。 本实验应用ELISA和RT-PCR的方法，对PNS在甲基强的松龙冲击治疗(MPT)前后血清IL-8含量及外周血单个核细胞(PBMC)IL-8 mRNA的表达情况进行检测，观察激素冲击治疗短时间内对IL-8在基因转录和蛋白水平的影响。 实验材料 一、研究对象 1．血清IL-8检测：观察组(分治疗前组、治疗后组)：2000年12月至2001年10月期间在我院儿科住院PNS患者30例。全部病例未用过激素或至少3个月内未用激素治疗过。男24例，女6例，其中单纯型21例，肾炎型9例。年龄1.5—14岁，平均8.5岁。对照组：18例，均为门诊健康体检儿童，男13例，女5例，年龄2—14岁，平均8岁。 2．PBMC IL－8mRNA表达检测：观察组（分治疗前组、治疗后组卜20例随机选自上述30例患者中，其中单纯型13例，肾炎型7例。对照组：8例随机选自上述18例健康儿童中。 二、实验试剂和仪器 人IL－8 ELISA试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司；Tr－iZ＊购于 GIBCO BRL USA公司；反转录试剂盒购于 GIBCO BRLUSA公司；EL－309（U．S．A）全自动酶标仪；pC－200 MJ g－SERCH USA PCR扩增仪；G15 700D天能数码凝胶扫描分析成像系统等。 实验方法 1．标本采集：激素冲击治疗（甲基强的松龙30m4Kg静脉滴注，连三天）前和冲击后（冲击结束第二天）分别采集静脉血ZInl和肝素抗凝血SInl。 2．ELISA试剂盒检测静脉血IL－8：参照使用说明，反应后标本即刻测量OD。＊值o分钟内人绘制标准曲线，算出样本中IL－8的浓度。 3．RT－PCR检测PBMC IL－8 mRNA表达：按照Tizol说明书提取总 RNA；按照 GIBCO BRL逆转录试剂盒手册合成 CDNA第一条链后进行PCR扩增（94t变性5分钟后，以94℃30秒35℃1分钟J72℃2分钟的顺序循环35次，最后72℃延伸10分钟人产物经琼脂糖凝胶电泳，滇化乙陡染色，经 GIS 700D天能数码凝胶扫描分析成像系统分析照相。IL－8引物序列：Upwnd吵iner：5 AAGGAACCATCTCAC硼；Downward primer：5 CAfI7C’ITGGATACCACAG3’，产物长度为347hP。6－achn弓物序列：UPward PriP。er：SCACTGTGTI’GGTACAGG’I3；Downwwh primer：STCAThAC－CA’t’tvinnAA’I’GG3；产物长度为154hP。 ·2· 4．统计处理：采用秩和检验统计方法。 实验结果 一JPT治疗前组、治疗后组、对照组血清IL—8含量 治疗前组血清IL－8含量7．14J52．08 Pg／ml，治疗后组IL－8水平明显下降4．27－77．86 Pyml，治疗前与治疗后组秩和检验的结果u＝4．26 P＜o．01；正常对照组血清IL 一8含量5．M－33．31 pg／Inl，治疗前组比正常对照组o－8蛋白水平明显增高，两者秩和检验的结果u＝4．53 P＜o刀＼虽然治疗后较治疗前组有明显下降，但与正常对照组仍有明显差异，两者秩和检验的结果u＝2．73 P＜0．01。 H抓pp治疗前组、治疗后组oJ 表达 甲基强的松龙冲击治疗前组IL－smRNA表达0．776－0．95，明显比治疗后组o－0．754强，两者秩和检验的结果u＝3．902 P＜0．01。同样在电泳图中可见，左侧治疗前扩增产物量明显比右侧治疗后的增多，且治疗前IL－8 mRNA条带明显比正常对照组的强（对照组表达皆为阴性人治疗前组与正常对照也有明显差异。 讨 论 IL－8可能参与了原发性肾病综合征中蛋白尿的形成。目前认为，PNS的蛋白尿是T细胞功能障碍、循环中细胞因子造成肾小球通透性改变的结果。Gdn指出，在复发的PNS患者PBMC培养上清液中有一种细胞因子，这种细胞困子能够诱发蛋白尿和促进肾小球对硫酸乙酚肝素的分解代谢。之后又通过研究发现复发的PNS患者的PBMC分泌的是IL－8，IL－8在复发的PNS患者PBMC培养的上清液及血清中升高。此外人 又通过应用与上 ·3·述上清液细胞因子相同浓度的IL－8注射人小鼠左肾动脉，同样能诱发蛋白尿和增强肾小球对硫酸乙酚肝素的分解代谢，应用抗IL－8中和抗体能减轻上清液细胞因子的作用，减轻蛋白尿的发生和肾小球对”硫的摄人量。这些实验现象进一步表明了 IL－8与PNS蛋白尿的形成有一定的关系。本实验中发现在治疗前组无论血清几－8蛋白水平还是PBMC mANA的表达都与正常对照组有明显的差异（P?