碱胁迫下尼罗罗非鱼miRNA的表达分析和靶基因的筛选鉴定

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我国拥有大量的盐碱水资源,但开发难度大、利用率低。尼罗罗非鱼是一种广盐性的经济鱼类,具有生长速度快、抗逆性强的特点。开展耐盐碱尼罗罗非鱼选育工作有利于盐碱水资源的开发利用,也有助于修复生态环境。同时,深入研究鱼类适应盐碱环境的机制可以为选育实践提供理论基础。本论文首先对不同碱度下尼罗罗非鱼鳃组织进行miRNAs高通量测序,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量方法,对随机挑选的有代表性的7个miRNA进行表达验证和靶基因分析;最后结合双荧光素报告实验和体内注射实验验证miR-192和SLC16A7的靶向关系,主要研究结果如下:(1)设置了2个碱度组AW4(4g/L Na HCO3)、AW6(6g/L Na HCO3)和淡水对照组FW。急性胁迫尼罗罗非鱼进行72h后,对鳃组织进行高通量测序和生物信息分析。结果发现,276个已知miRNA表达,其中包含42个随碱度升高表达持续显著升高的miRNAs(P<0.05),21个随碱度升高表达持续显著降低的miRNAs(P<0.05)。此外,还存在随碱度升高有表达差异,但变化规律不持续的miRNAs。从中随机选取4个持续上调/下调(miR-24a、miR-30d、miR-143、miR-155)和3个非持续变化(miR-122、miR-192和miR-194a)miRNAs进行靶基因预测和KEGG富集分析,发现钙信号通路和MAPK信号等通路被显著富集。(2)对罗非鱼进行急性碱胁迫实验(AW4、AW6),检测96h内的上述7个miRNA(miR-24a、miR-30d、miR-143、miR-155、miR-122、miR-192和miR-194a)和6个预测靶基因(slc20a1a、nme3、SLC16A7、them4、SLC7A1、igfbp5a)的表达变化。结果表明,7个miRNAs的表达基本符合测序结果,并发现2对可能的靶向关系(miR-122和slc20a1a、miR-192和SLC16A7)。(3)选取对应关系较明确的一组(miR-192和SLC16A7)进一步验证靶向关系。双荧光素报告实验表明,miR-192通过与SLC16A7的3’UTR结合的方式,抑制了SLC16A7的表达。体内注射miR-192抑制剂antagomir,miR-192表达降低,SLC16A7表达增加。说明miR-192和SLC16A7参与了罗非鱼应答碱胁迫的过程,发挥了重要的生物学作用。
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