论文部分内容阅读
传统的遗传转化中,普遍使用完整质粒DNA,非目的基因的质粒载体主干序列经常随着目的基因整合到植物基因组中,并通过形成稳定的次级结构,产生重组热点或导致异常重组,重组产生的基因多拷贝经常导致转基因的低表达甚至基因沉默。近年来随着转基因植物的产业化种植和人们对生物安全性的关注,非目的基因的载体DNA序列也作为“垃圾DNA”影响受体基因组的安全性评价。基因枪转化法可将去除质粒载体主干序列的外源基因表达框导入植物基因组,获得较为安全的转基因植株。本课题以粳稻品种日本晴和籼稻品种明辉63为受体材料,以bar基因作为外源基因,研究洁净DNA转化的优化技术条件。利用无标记基因转化系统,将bar基因表达框通过基因枪法直接导入植物细胞,研究转化受体材料和基因枪轰击参数对洁净DNA转化效率的影响。主要结果如下：(1)以28℃光照,28℃黑暗,32℃光照与32℃黑暗分别作为愈伤的诱导条件,探究不同条件下诱导的水稻成熟胚愈伤组织作为转化受体材料对洁净DNA转化率的影响。结果表明,32℃光培养诱导的愈伤经过一次继代后作为转化受体材料,得到的转化效率最高,达到9.32%;以初代培养,一次继代培养,二次继代培养的愈伤组织分别作为受体材料,探究不同时期的愈伤组织对进行洁净DNA转化率的影响。结果表明,经过一次继代培养的愈伤组织进行基因枪轰击时,转化率最高；在相同的培养条件下,粳稻“日本晴”和籼稻“明辉63”的愈伤组织,经一次继代培养后作为基因枪轰击的受体材料,粳稻的转化率要明显高于籼稻。(2)以亚精胺和鱼精蛋白作为DNA沉淀剂,探究不同类型的沉淀剂对洁净DNA转化率的影响。结果表明,当DNA浓度是2ug/6枪时,与亚精胺组相比,鱼精蛋白组最后所得植株的阳性植株率和转化率均得到极其显著性的提高。在浓度相同的情况下,鱼精蛋白作为沉淀剂时,最终获得植株转化率均要比亚精胺作为沉淀剂时获得的植株转化率高。以在2.5ng/枪,25ng/枪,2ug/6枪的三个DNA浓度研究不同浓度DNA对洁净DNA转化率的影响。结果表明,当亚精胺作为沉淀剂,2.5ng/枪的DNA浓度进行基因枪轰击时,最终获得植株的阳性植株率和转化率均比2ug/6枪组显著性降低。鱼精蛋白作为沉淀剂,2.5ng/枪的DNA浓度进行基因枪轰击时,其最终获得绿苗分化率为,阳性植株率和转化率都比2ug/6枪组极其显著性降低。25ng/枪的DNA浓度时,绿苗分化率比2ug/6枪组显著性降低。由此说明,在鱼精蛋白作为沉淀剂时,不同的DNA浓度对绿苗分化率,阳性植株率和转化率都有一定的影响。选用相同的DNA沉淀剂,在2.5ng/枪,25ng/枪,2ug/6枪的浓度范围内,2ug/6枪的转化率最高,达到9.64%,并且在这三个浓度范围内,转化率随着DNA浓度的增加而提高。此外,Southern杂交结果表明选用不同浓度的DNA进行洁净DNA转化,最后所得转基因植株的拷贝数各不相同。并且,利用低浓度的DNA进行基因枪轰击,都获得了低拷贝整合简单的转基因植株。