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目的:通过构建过氧化氢(H2O2)对大鼠H9c2心肌细胞损伤的模型,明确大黄酸对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用,并探讨其可能的分子机制。方法:体外培养大鼠H9c2心肌细胞,利用H2O2刺激H9c2心肌细胞,建立大鼠H9c2心肌细胞损伤模型。实验分为5组:空白对照组(Control)、H2O2诱导组、大黄酸(Rhein)低、中、高剂量组(0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、μg/mL)。①用噻唑蓝法(MTT法)检测Rhein对H9c2心肌细胞活性的影响。②EdU实验检测Rhein对H9c2心肌细胞增殖能力的影响。③克隆形成实验检测Rhein对H9c2心肌细胞克隆形成能力的影响。④流式细胞实验检测Rhein对H9c2心肌细胞凋亡水平的影响。⑤RT-qPCR检测凋亡相关指标(Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA)的水平。⑥Western blotting 检测 Rhein 对 H9c2 心肌细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9凋亡相关蛋白的影响;免疫荧光检测Rhein对H9c2心肌细胞中Caspase-3表达的影响。⑦酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测Rhein对H9c2心肌细胞中白介素-1β(IL-1β)、白介素-1α(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)炎症相关因子表达。⑧ROS荧光探针检测Rhein对H9c2心肌细胞内ROS表达水平的影响。⑨生化法检测Rhein对H9c2心肌细胞中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等氧化应激标志物水平的影响。⑩Western blotting检测H9c2心肌细胞中MAPK和NF-κB信号通路的表达。研究数据建立Excel数据库,并进行统计学处理。研究结果:1.大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤模型的建立:300 μmol/L H2O2处理H9c2心肌细胞2 h后,细胞损伤明显,故用此浓度建立心肌细胞的氧化损伤模型。2.细胞活力:MTT实验结果表明,与Control组相比,H202能够显著抑制H9c2心肌细胞的活力。Rhein各浓度干预后,H9c2心肌细胞活力显著增强且呈一定的剂量依赖关系。3.细胞增殖能力:EdU实验结果表明,与Control组相比,H202能够显著抑制H9c2心肌细胞的增殖能力,Rhein各浓度组干预后,H9c2心肌细胞的增殖能力显著增强且呈一定的剂量依赖关系;克隆形成实验结果表明,与Control组相比,H202能够显著抑制H9c2心肌细胞的克隆形成能力,Rhein各浓度干预后,H9c2心肌细胞的克隆形成能力显著增强且呈一定的剂量依赖关系。4.细胞凋亡:流式凋亡实验结果表明,与Control组相比,H2O2能够显著促进H9c2心肌细胞的凋亡,Rhein各浓度干预后,H9c2心肌细胞的凋亡显著减弱,且呈一定的剂量依赖关系;RT-qPCR实验结果表明,与Control组相比,H2O2能够促进H9c2心肌细胞中Bax、Caspase-3 和 Caspase-9 mRNA 的表达,抑制 Bcl-2 mRNA 的表达;而 Rhein 干预后,能够显著抑制Bax、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达,促进Bcl-2 mRNA的表达;Westerm blotting实验检测H9c2心肌细胞中凋亡相关蛋白的表达水平,结果表明与Control组相比,H2O2组细胞发生凋亡明显增加,促进H9c2心肌细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达;而Rhein各浓度组干预后,细胞凋亡明显减少,能够显著抑制Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达,促进Bcl-2蛋白的表达;免疫荧光实验检测Caspase-3的表达水平,结果表明与Control组相比,H2O2能够显著促进Caspase-3的表达,而Rhein各浓度干预后,Caspase-3的表达量显著减低。5.炎症反应:ELISA实验结果表明,与Control组相比,H2O2能够促进H9c2心肌细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-1α炎症相关因子的表达,而Rhein各浓度组干预后,IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-1α炎症相关因子的表达量显著降低且呈一定的剂量依赖关系。6.氧化应激:ROS荧光探针实验结果表明,与Control组相比,H202能够促进H9c2心肌细胞中ROS的表达水平,而Rhein各浓度组干预后,H9c2心肌细胞中的ROS表达水平显著降低,且呈一定的剂量依赖关系;生化法检测结果表明,与Control组相比,H202能够增加H9c2心肌细胞中MDA含量,抑制GSK-Px、CAT、SOD的表达;而Rhein各浓度组干预后,MDA含量显著降低,GSK-Px、CAT、SOD的表达显著升高,且呈一定的剂量依赖关系。7.信号通路的表达:与Control组相比,H202能够激活H9c2心肌细胞中MAPK和NF-κB信号通路,而Rhein能够显著抑制MAPK和NF-κB信号通路的表达,且呈一定的剂量依赖关系。研究结论:1.应用一定浓度的H202处理H9c2心肌细胞可以成功建立大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤模型。H2O2能够显著抑制心肌细胞的活力及增殖能力,促进心肌细胞的凋亡,促进心肌细胞中损伤相关炎症因子的表达,促进心肌细胞的氧化应激损伤。2.Rhein明显增强H2O2诱导的心肌细胞活力及增殖能力,减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡。3.Rhein明显抑制H2O2诱导的心肌细胞炎症反应,增加心肌细胞清除氧自由基、活性氧的能力。4.Rhein能够减轻H2O2诱导的心肌细胞损伤,其机制可能是通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的表达进而保护心肌细胞。5.Rhein对心肌细胞的保护作用,主要体现在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、抑制炎症反应及抗氧化应激损伤等方面。该研究结果为进一步研究中药大黄及大黄酸在心肌保护及心血管疾病防治中的作用提供了一定的理论依据。