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背景和目的:高脂血症(hyperlipidemia)是多种心血管疾病的首要独立危险因素,我国人群通常以总胆固醇(total cholesterol,TC)或低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-c)水平升高为特点。尽早积极主动地控制血脂水平(特别是TC和LDL-c水平)对于心血管疾病的防治具有重要意义。CCDC92基因定位于血脂异常和冠心病的易感区域。遗传学分析显示该基因与血液胆固醇颗粒的平均粒径大小有关,能够通过胰岛素抵抗途径导致脂肪组织功能障碍,影响心血管疾病的发生发展。本研究应用loss-of-function和gain-of-function策略,通过体外和体内实验探索CCDC92基因在血浆LDL-c代谢中的生物学功能。基于高通量测序数据,探讨小鼠高脂血症模型中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达特征及竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)调控网络,筛选出lncRNA介导的调控血脂代谢异常的关键ceRNA通路。方法:1.在HepG2细胞,过表达或敲低内源性CCDC92基因,应用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞内LDLR、PCSK9、SREBP2和IDOL基因等经典脂代谢相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;应用ELISA检测细胞上清中PCSK9蛋白分泌量的变化;应用功能回复实验进一步探索CCDC92基因的作用机制。2.在C57BL/6J野生型小鼠和ApoE-/-小鼠,经尾静脉注射过表达CCDC92基因或敲低Ccdc92基因的腺相关病毒 8 型(adeno-associated virus type 8,AAV8),以构建肝脏靶向过表达CCDC92基因或敲低Ccdc92基因的小鼠模型。给予普通饲料或高脂饲料喂养,并设置不同时间点取材肝脏和血浆。应用qRT-PCR和Western blot分别检测小鼠肝脏组织中病毒的过表达或敲低效率,及经典脂代谢相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;应用ELISA检测小鼠血浆中PCSK9蛋白分泌水平的变化;应用胆固醇测定试剂盒检测小鼠血浆中胆固醇(TC、LDL-c、HDL-c 和 TG)水平的变化。3.对过表达CCDC92基因且高脂喂养12周的ApoE-/-小鼠的肝脏组织进行转录组测序,以FC>1.5和P<0.05作为筛选条件,筛选得到差异表达的基因;应用生物信息学方法对差异表达的基因进行聚类分析、基因功能(Gene Ontology,GO)分析和信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)注释;应用文献功能学检索筛选得到重点基因,进一步探索CCDC92基因调控循环胆固醇代谢的潜在靶点和作用机制。4.应用正常饮食和高脂饮食分别喂养ApoE-/-小鼠12周,建立高脂血症模型;应用肝脏全转录组测序,筛选得到差异表达的lncRNAs、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)和信使 RNAs(messenger RNAs,mRNAs);对差异表达的 mRNAs 进行GO分析和KEGG注释;结合lncRNA-mRNA共表达关系、miRNA-mRNA靶向关系、lncRNA-miRNA共表达和靶向关系,构建出小鼠高脂血症模型肝脏中lncRNA介导的ceRNA调控网络,并从中筛选得到关键的ceRNA调控轴。结果:1.在HepG2细胞中,敲低CCDC92基因显著上调LDLR蛋白表达水平,下调PCSK9蛋白分泌水平;过表达CCDC92基因显著下调LDLR蛋白表达水平,上调PCSK9蛋白分泌水平;而LDLR和PCSK9基因在mRNA水平的表达无显著变化。功能回复实验表明,PCSK9基因参与CCDC92基因对LDLR蛋白表达的调控作用。2.在C57BL/6J野生型小鼠中,AAV8-TBG-CCDC92注射组小鼠在普通饲料喂养3周,CCDC92基因在肝脏被成功过表达;高脂饲料喂养3周,肝脏中Ldlr、Pcsk9和Idol等经典脂代谢相关基因的mRNA水平无显著变化,LDLR蛋白表达水平显著降低,PCSK9蛋白表达水平显著增加;血浆中PCSK9蛋白分泌水平显著增加;血浆TC水平和LDL-c水平无显著变化。反之,AAV8-Ccdc92-shRNA注射组小鼠在普通饲料喂养3周,Ccdc92基因在肝脏被成功敲低;高脂饲料喂养3周,肝脏中Ldlr、Pcsk9和Idol等经典脂代谢相关基因的mRNA水平无显著变化,LDLR蛋白表达水平显著增加,PCSK9蛋白表达水平显著降低;血浆中PCSK9蛋白分泌水平显著降低;血浆TC水平和LDL-c水平无显著变化。将对照组和AAV8-TBG-CCDC92注射组小鼠的高脂饲料喂养时间延长至18周,肝脏中Ldlr、Pcsk9和Idol等经典脂代谢相关基因的mRNA水平无显著变化,LDLR蛋白表达水平显著降低,PCSK9蛋白表达水平显著增加;血浆中PCSK9蛋白分泌水平显著增加;同时血浆中TC和LDL-c水平显著升高。3.在ApoE-/-小鼠中,无论是过表达CCDC92基因且高脂饲料诱导6周或12周,还是敲低Ccdc92基因且高脂饲料诱导6周或10周,qRT-PCR、Western blot和ELISA的检测结果都与高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠3周对应的检测结果一致。血脂测定结果显示,与对照组相比,过表达组小鼠在给予高脂饲料喂养6周,血浆中TC和LDL-c水平无显著变化;在高脂饲料喂养12周,血浆中TC和LDL-c水平显著升高,同时腹部脂肪堆积明显增多。反之,敲低组小鼠在高脂饲料喂养6周和10周,血浆中TC和LDL-c水平均显著降低。4.根据肝脏转录组测序结果,ApoE-/-小鼠肝脏靶向过表达CCDC92基因且高脂饲料喂养12周,有1717个基因的mRNA表达水平发生显著变化,其中包括840个基因的mRNA水平显著增加和877个基因的mRNA水平显著降低;很多介导胆固醇代谢过程的基因群组的表达及信号通路的富集都发生显著改变,包括胆固醇代谢通路、动脉粥样硬化通路、脂肪酸延长通路、不饱和脂肪酸生物合成通路、脂肪消化和吸收通路、PPAR信号通路和ABC转运体通路等。5.根据ApoE-/-小鼠高脂血症模型的肝脏全转录组测序结果,共筛选得到117个差异表达的lncRNA、53个差异表达的miRNA和1689个差异表达的mRNA;差异表达的mRNAs主要涉及脂质代谢过程、脂肪酸代谢过程和类固醇代谢过程等生物学功能,参与PPAR信号通路和不饱和脂肪酸合成等途径;构建的小鼠高脂血症模型ceRNA调控网络共纳入16个lncRNA节点、18个miRNA节点和33个mRNA节点,其中lnc-Dubr介导的ceRNA调控轴可能对血脂代谢异常具有重要的调控作用。结论:1.体外实验表明,在HepG2细胞中CCDC92基因可能通过调节PCSK9蛋白分泌而调控LDLR蛋白表达。2.体内实验表明,在C57BL/6J野生型小鼠和ApoE-/-小鼠中,给予高脂饲料喂养.的条件下,肝脏靶向过表达CCDC92基因能促进PCSK9蛋白表达及血浆分泌,抑制肝脏LDLR蛋白表达,升高血浆LDL-c水平;反之,肝脏靶向敲低Ccdc92基因能抑制PCSK9蛋白表达及血浆分泌,促进肝脏LDLR蛋白表达,降低血浆LDL-c水平。由此推测CCDC92基因可能通过影响PCSK9蛋白表达及分泌的过程而调控肝脏LDLR蛋白表达水平,进而调控循环LDL-c水平。3.肝脏转录组测序结果表明,小鼠肝脏靶向过表达CCDC92基因能诱导很多参与胆固醇代谢过程的基因群组及信号通路发生显著变化。进一步提示CCDC92基因有望成为高脂血症防治的潜在新靶点。4.成功绘制出高脂血症小鼠肝脏lncRNA介导的ceRNA调控网络,并筛选出具有潜在生物学作用的ceRNA调控轴,有望为高脂血症及其他心血管疾病发生发展的机制研究和治疗靶点研究提供新的线索。