炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种非特异性、病情反复发作的肠道疾病,并且发病率正呈现出急剧增长的趋势。然而,到目前为止,现有的治疗药物疗效并不太理想,IBD病情容易反复,而反复发作的IBD,已经被证实了是诱发结肠炎相关性结直肠癌（Colitis-associated colorectal cancer,CAC）的主要原因。因此,开发更理想的防治IBD和CAC药物迫在眉睫。许多传统中药已经被证实在多种疑难杂症上具有良好的治疗效果。基于中医药传统临床实践经验,采用现代医学研究手段对某些功效特殊的中药进行针对性开发、验证,往往能获得一些惊喜的发现。铁皮石斛作为我国一种传统名贵的中草药,被誉为“九大仙草”之首,久服具有“厚肠胃”的功效,可用于治疗肠澼。基于此,在本研究中,我们对铁皮石斛是否能防治IBD和CAC开展深入研究,为铁皮石斛的进一步开发和应用提供实验依据。目的铁皮石斛具有“厚肠胃”功效,亦有治疗肠澼的药用记载。而现代研究发现铁皮石斛主要活性成分多糖（Dendrobium Officinale polysaccharides,DOPS）具有增强肠道屏障功能、抗肿瘤、抗炎及免疫调节等药理作用。因此,本研究拟验证DOPS对于IBD及CAC的防治作用,并对其作用机制进行初步研究。方法:1.铁皮石斛多糖提取、分离纯化、质量评价及药效筛选1.1铁皮石斛多糖提取、分离纯化及质量评价首先榨汁法提取铁皮石斛粗多糖;随后采用碱性硼酸盐缓冲溶液强化DEAE-52纤维素柱层析的方法对DOPS进行分级纯化;采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、硫酸-间羟联苯法、氯化钡-明胶比色法分别测定DOPS各分级纯化组分的总糖、蛋白、糖醛酸及硫酸基含量。运用分子排阻高效液相色谱法、红外光谱法、糖腈乙酸酯衍生物-气相色谱法分别测定分别测定DOPS各分级纯化组分的分子量分布、官能团特征及单糖组成特征,评价其质量。1.2 DOPS1,DOPS2和DOPS3体外药效筛选以RAW264.7细胞为研究对象,采用MTT方法来筛选细胞药效实验的给药浓度;采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,以促炎因子TNF-α作为评价指标,考察DOPS1,DOPS2和DOPS3的药效差异。2.DOPS1防治急性IBD实验研究2.1 DOPS1对DSS诱导小鼠炎症性肠病动物模型的治疗作用根据铁皮石斛多糖各组分得率高低,首先选用得率最高的DOPS1进行药效研究。自由饮用4%DSS来诱导小鼠IBD动物模型,造模的同时开始灌胃DOPS1进行防治。DOPS1低、中、高给药组灌胃剂量分别为50、100、200 mg/kg/day,每天给药1次;Normal组、DSS模型组分别灌胃等容量的蒸馏水。将动物整体体征、体重下降百分数、DAI评分、结肠宏观评分、炎症因子水平、免疫器官及结肠组织病理学检查等作为药效考察指标,并采用异硫氰酸荧光素-硫酸葡聚糖来检测肠道通透性。根据上述研究指标结果探讨DOPS1对DSS诱导急性IBD小鼠的治疗作用。2.2 DOPS1抑制LPS诱导NCM460细胞炎症损伤的影响以NCM460细胞为研究对象,采用MTT方法来筛选细胞药效实验的给药浓度;采用LPS诱导NCM460细胞炎症损伤体外细胞模型,以促炎因子TNF-α和IL-1β的水平作为评价指标,考察DOPS1对NCM460细胞炎症损伤的抑制作用。3.DOPS1防治CAC的实验研究3.1 DOPS1对AOM联合DSS诱导CAC动物模型的治疗作用采用AOM（10 mg/kg）腹腔注射一次,然后给予2%DSS。结直肠癌模型动物经历三个2%DSS处理周期（模拟临床IBD反复发作）,每个造模期以2%DSS连续自由饮用7天和14天自由饮用蒸馏水组成。造模第一周期结束后,开始给予DOPS1。DOPS1低、中、高给药组灌胃剂量分别为50、100和200 mg/kg/day;Normal组、AOM/DSS模型组分别灌胃等容量的蒸馏水。将动物整体体征、体重下降百分数、DAI评分、结肠宏观评分、肿瘤的数量及大小、炎症因子水平、结肠组织病理学检查等作为药效考核指标,评价DOPS1对CAC小鼠的保护作用。4.DOPS1抑制CAC形成发展的作用机制4.1 DOPS1对CAC动物模型的肠道黏膜机械屏障及CD8+T细胞的调控采用异硫氰酸荧光素-硫酸葡聚糖来检测肠道通透性。考察DOPS1对AOM联合DSS诱导CAC小鼠的治疗作用。采用免疫荧光技术检查结肠组织非肿瘤区和肿瘤区CD8+T细胞、ZO-1和Occludin蛋白表达情况,分析DOPS1对CAC小鼠结肠组织肠道屏障机械调控蛋白及免疫-炎症细胞的影响。4.2 DOPS1对CAC动物模型肿瘤微环境中CD8+T细胞功能的改善通过检查DOPS1对肿瘤微环境淋巴细胞ATP的含量,考察DOPS1对免疫细胞能量代谢的作用。检测肿瘤组织中IFN-γ的表达量,采用流式细胞术检测肿瘤微环境中CD8+T细胞线粒体数量,检测肿瘤微环境中CD8+T细胞PD-1的表达情况,考察DOPS1对肿瘤微环境中CD8+T细胞活性的影响。结果:1.铁皮石斛多糖提取、分离纯化、质量评价及药效筛选1.1铁皮石斛多糖提取、分离纯化及质量评价铁皮石斛粗多糖得率为14.75%,通过分离后得到DOPS-1、DOPS-2及DOPS-3三个组分。DOPS1、DOPS2、DOPS3的平均总糖含量分别为92.47%、94.64%和90.85%。它们均不含蛋白质、糖醛酸和硫酸基。3个纯化组分的分子量分别为393.8 k Da、408.7k Da和364.2 k Da。DOPS1、DOPS2及DOPS3均由甘露糖和葡萄糖组成,其中以甘露糖为主。甘露糖与葡萄糖的摩尔比分别为3.33:1、3.12:1及3.20:1。1.2 DOPS1,DOPS2和DOPS3体外药效筛选MTT的结果确定了DOPS1,DOPS2和DOPS3后续细胞药效实验的给药浓度分别为200,200和400μg/m L。DOPS1,DOPS2和DOPS3对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的干预作用显示,DOPS1的抗炎作用最强,其次是DOPS2,DOPS3的抗炎效果较弱。2.DOPS1能够防治急性IBD动物模型2.1 DOPS1对DSS诱导急性IBD小鼠模型具有防治作用与Normal组比较,DSS造模后,DSS模型组动物的体重、进食及进水明显下降（P<0.01）;动物稀便、血便及DAI评分明显增加、结肠长度明显萎缩（P<0.05或P<0.01）;结肠宏观评分明显升高（P<0.01）;结肠组织病理学结果显示炎症细胞浸润明显;脾脏系数明显升高（P<0.01）;促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和IFN-γ的水平明显升高（P<0.01）;抑炎因子IL-10的表达水平略升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;IL-1β/IL-10,IL-18/IL-10和TNF-α/IL-10比值显著性升高（P<0.01）;给予了DOPS1后,IBD动物体重、进食量恢复明显（P<0.05或P<0.01）;动物稀便、血便及DAI评分明显减少（P<0.05或P<0.01）;结肠长度恢复明显（P<0.01）、结肠组织病理学显示炎症浸润明显减少;脾脏系数显著性下降（P<0.05或P<0.01）;促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和IFN-γ的表达水平呈剂量依赖性减少（P<0.05或P<0.01）;抑炎因子IL-10的水平差异无统计学意义（P>0.05）;IL-1β/IL-10,IL-18/IL-10和TNF-α/IL-10比值显著性降低（P<0.05）;此外,DSS模型组动物肠道通透性明显增加（P<0.05）,而DOSP1给药组动物肠道通透性呈现出剂量依赖性下降（P<0.05）。2.2 DOPS1抑制LPS诱导NCM460细胞炎症损伤的影响MTT的结果确定了DOPS1后续细胞药效实验的给药浓度为:50,100和200μg/m L。LPS刺激NCM460细胞后,TNF-α和IL-1β细胞因子的水平明显升高,与空白对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与LPS组比较,DOPS1能够剂量依赖性地下调促炎因子TNF-α和IL-1β的水平,DOPS1中剂量组能够显著地下调IL-1β的水平（P<0.05）;DOPS1高剂量组抑制TNF-α和IL-1β的分泌最为明显,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3.DOPS1对CAC动物模型的防治作用研究与Normal组比较,AOM联合DSS诱导CAC小鼠动物的体重明显下降（P<0.05或P<0.01）;动物稀便、血便及DAI评分明显增加（P<0.01）、结肠长度明显缩短（P<0.01）;结肠组织病理学显示炎症细胞浸润明显;结肠肿瘤的数量及直径大的肿瘤数明显增多（P<0.01）;脾脏明显肿大（P<0.01）;在非肿瘤和和肿瘤区,AOM/DSS模型组结肠促炎因子IL-1β、TNF-α的水平明显升高（P<0.01）;抑炎因子IL-10的表达水平有一定程度升高,但差异无统计学意义（P>0.05）而其促炎/抑炎因子的比值显著性升高（P<0.05或P<0.01）。给予了DOPS1后,动物体重恢复明显（P<0.05或P<0.01）;动物稀便、血便及DAI评分明显减少（P<0.05或P<0.01）;结肠长度恢复明显（P<0.01）、结肠组织病理学显示炎症浸润明显减少（P<0.05）;结肠肿瘤的数量及直径大的肿瘤数明显减少（P<0.05或P<0.01）;在非肿瘤区,促炎因子IL-1β和TNF-α的表达水平呈剂量依赖性减少（P<0.05或P<0.01）;抑炎因子IL-10的表达水平、促炎/抑炎因子的比值等则差异无统计学意义（P>0.05）;在肿瘤区,DOPS1给药后,促炎/抑炎因子比值剂量依赖性下降,其中高剂量组下降最为明显（P>0.05）。4.DOPS1抑制CAC形成发展的作用机制4.1 DOPS1对CAC动物模型的肠道黏膜机械屏障及CD8+T细胞的调控肠道通透性的结果显示,AOM/DSS模型组动物肠道通透性明显高于Normal组（P<0.01）,而给予了DOPS1后,DOPS1能够明显抑制CAC动物肠道通透性的增加（P<0.01）。免疫荧光的结果显示,在非肿瘤区,AOM/DSS模型组动物结肠组织CD8+T细胞的表达明显升高（P<0.01）,ZO-1和Occludin的表达明显下降（P<0.05或P<0.01）;给予了DOPS1后,动物结肠组织CD8+T细胞的表达明显下降（P<0.05或P<0.01）,而ZO-1和Occludin的表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。在肿瘤区,AOM/DSS模型组动物结肠组织CD8+T细胞的表达明显升高（P<0.01）,ZO-1和Occludin的表达明显下降（P<0.01）。给予了DOPS1后,动物结肠组织CD8+T细胞的表达略升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;而ZO-1和Occludin的表达明显升高（P<0.01）。4.2 DOPS1对CAC动物模型肿瘤微环境中CD8+T细胞功能的改善与Normal组比较,AOM/DSS模型组动物肿瘤微环境中淋巴细胞ATP的含量明显降低（P<0.01）,IFN-γ的表达变化不明显;肿瘤微环境中CD8+T细胞中线粒体的含量明显下降（P<0.01）、PD-1的表达明显升高（P<0.05）。给予了DOPS1后,给药组动物肿瘤微环境中IFN-γ的表达、淋巴细胞ATP的含量均明显升高（P<0.05）;CD8+T细胞线粒体的数量显著性升高（P<0.05）、PD-1的表达显著下调（P<0.05或P<0.01）。结论:1.DOPS1是铁皮石斛含量最高、得率最大的一种多糖组分,抗炎活性最强。2.DOPS1能够改善DSS诱导急性小鼠IBD模型的相关肠炎症状,缓解LPS诱导NCM460细胞炎症损伤。3.DOPS1能够改善AOM联合DSS诱导小鼠CAC模型动物的相关慢性肠炎症状,抑制结肠肿瘤的形成发展,对CAC模型有治疗作用。DOPS1防治CAC模型动物的作用与其改善肠道机械蛋白的表达、提高肿瘤微环境中CD8+T细胞代谢免疫功能有关。