背景代谢综合征是一组以腹型肥胖、高血糖、高血压以及血脂异常为主要特征的症候群,发病机制以慢性低度炎症、胰岛素抵抗为核心,其全球的发病率正逐年上升。胰岛素抵抗是多种代谢相关疾病的共同病理生理基础及共有的危险因素。迄今为止,肥胖相关的胰岛素抵抗的发病机制仍未完全阐明,也缺乏有效的防治方法。在长期营养过剩及肥胖状态下,脂肪组织过度增加引起的游离脂肪酸水平升高,炎症和应激信号活化,如JNK和IKKs,可使胰岛素受体底物1（Insulin receptor substratel,IRS1）的丝氨酸磷酸化增多、酪氨酸磷酸化减少,从而导致胰岛素信号转导异常,促进胰岛素抵抗。此外,在过度肥胖时,肠道菌群失调诱导的内毒素（LPS,lipopolysaccharide,endotoxin）水平升高,可以通过Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）介导激活炎症信号通路,产生一系列炎症因子,如IL-1β、IL-6、TNFα IL-12p40、IFNβ等,导致胰岛素作用靶组织,如肝脏、骨骼肌中胰岛素信号转导异常。E3泛素连接酶Peli1,作为Toll样受体/白介素-1受体（TLRs/Interleukin-1 receptor,TLRs/IL-1R）介导的信号通路中的关键调控分子,在炎症反应及细胞损伤和凋亡的调节中发挥了重要作用。Peli蛋白在其N-末端与C-末端分别具有FHA结构域和RING结构域,其中RING结构域最广为人知的便是其E3泛素连接酶活性。研究表明,Peli1敲除可抑制腹腔注射LPS、Poly（I:C）诱导的小鼠体内IL-6、TNF-α等炎症因子的表达上调,其机制与Peli1调控TLRs/IL-1R信号通路中关键信号分子RIP1的泛素化,以及核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的转录活性有关;在中枢神经系统的炎症反应中,Peli1可以通过促进cIAP的泛素化,引起TRAF3的泛素化降解,提高转录因子AP-1的活性;负性调控因子Smad6可以通过与Peli1的相互作用抑制IL-1β引起的信号通路激活。课题组前期的研究发现,在小鼠心肌肥厚及心肌缺血-再灌注损伤模型中,Peli1蛋白表达的增加及其E3泛素连接酶活性的激活可以促进病理性心室重构,抑制Peli1蛋白表达可以减轻心肌组织的炎症浸润,改善心肌细胞的凋亡,其机制与Peli1可以促进TRAF6的泛素化,抑制NF-κB的转录活性有关。大量研究表明,胰岛素抵抗或者2型糖尿病可伴有脂代谢紊乱及线粒体功能异常。线粒体氧化功能的减退,线粒体生物合成的减少,尤其是与线粒体氧化代谢相关基因水平如肉毒碱棕榈酰转移酶Iα（carnitine palmitoyltransferase I,CPT1 A）,过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor-coactivator 1α,PGC1α）,肝细胞核因子-4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha;HNF4α;HNF4A）等的明显降低,可引起细胞氧化能力的减低,导致细胞内脂质积聚增多。HNF4α调控着许多参与到胆汁酸,脂质,葡萄糖和药物代谢基因的基础表达。HNF4α敲除可显著增加小鼠脂肪肝和高脂血症的易感性。此外,人的HNF4α的突变能够导致自发性青少年单基因型的2型糖尿病（MODY）。最新研究表明,HNF4α可以结合到CPT1A的启动子上的DR1结构域上,与PGC1α一起介导CPT1α的转录活化,促进肝脏中的线粒体脂肪酸的氧化,在脂质代谢中发挥重要作用。研究表明,增加脂肪酸的α氧化能够减少肥胖和改善胰岛素抵抗,这是对代谢综合征进行干预的一个重要靶点。Peli1是否能够通过调控HNF4α的表达,以及TLRs/IL-1R介导的信号通路转导在肥胖相关的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗中发挥一定的作用,目前尚不清楚。而且,Peli1参与肥胖相关的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗调控的分子机制也有待阐明。目的1.明确Peli1对高脂饮食诱导小鼠肝脏脂代谢紊乱的调控作用及其分子机制2.阐明Peli1敲除是否对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗具有改善作用3.阐释Peli1对FFA诱导原代肝细胞Traf3/MAPKs/炎症信号的调控作用方法一、模型建立1.动物模型为了阐明Peli1缺失对高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗的作用,通过给予小鼠高脂饮食喂养16周模拟肥胖诱导的小鼠胰岛素抵抗模型。6周C57BL/6雄性小鼠随机分为四组,分别是:野生型+对照饮食组（WT-Chow）,野生型+高脂饮食组（WT-HFD）,Peli1敲除+对照饮食组（Peli1-/--Chow）,Peli1敲除+高脂饮食组（Peli1-/--HFD）。观察Peli1对高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和代谢性炎症的作用。2.细胞模型肥胖时,高水平的脂肪酸可通过直接代谢产生炎症介质或/和通过不同的模式识别受体,激活多种炎症信号通路,最后引起代谢性炎症。为阐明Peli1调控高脂饮食诱导胰岛素抵抗的分子机制,我们以500 μM的游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）和100 μg/ml的poly（I:C）刺激原代肝细胞,枯否细胞和胚胎成纤维细胞诱导体外细胞发生胰岛素抵抗的应答反应。观察:Peli1敲除对FFA和poly（I:C）诱导的细胞胰岛素抵抗的影响;Peli1缺失对FFA和poly（I:C）诱导的炎症因子水平的影响。探讨Peli1敲除调控FFA和poly（I:C）诱导胰岛素抵抗和炎症因子分泌作用的分子机制。二、观察指标与方法通过记录体重,计算肝脏重/体重,白色脂肪重/体重,血清学检测,以及进行H/E染色观察肝脏脂质沉积,脂肪组织炎症浸润,计算脂肪细胞大小评价肥胖程度。通过TSE动物代谢测量分析系统监测小鼠生理代谢和行为学;通过qRT-PCR检测脂质代谢相关基因的mRNA水平;通过Western blot检测总蛋白、胞浆蛋白和胞核蛋白里的HNF4α蛋白水平;通过免疫沉淀检测IRS1的酪氨酸磷酸化,以及胞核蛋白里的HNF4α蛋白泛素化水平;通过qRT-PCR检测HNF4α的mRNA水平。通过葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验评价胰岛素抵抗情况;通过Western blot检测Peli1的蛋白表达、IRS1的磷酸化、AKT的磷酸化水平。通过Western blot检测MAPKs的磷酸化水平,Traf3和cIAP2的蛋白水平;通过免疫沉淀检测Traf3和cIAP2蛋白泛素化水平;通过Western blot检测胞浆蛋白、胞核蛋白里的干扰素调节因子3（Interferon regulatory Factor 3,IRF3）蛋白水平和磷酸化水平;通过EMSA检测NF-κB的核转位情况;通过qRT-PCR检测炎症因子的mRNA水平。结果一、Peli1敲除对高脂饮食诱导小鼠肥胖具有保护作用1、Peli1敲除对小鼠脂肪组织过度增加的影响1.1高脂饮食喂养16周,每周记录小鼠体重,WT-Chow组与Peli1-/--Chow组相比体重无明显差别,WT-HFD组与WT-Chow组相比体重呈持续上升趋势,Peli1敲除可明显改善此现象。1.2高脂饮食喂养16周,H&E染色显示与周龄相匹配的普通饮食组小鼠相比,小鼠附睾脂肪和皮下脂肪重量增加,脂肪细胞横截面面积增加。同时,高脂饮食组棕色脂肪细胞面积较普通饮食组明显增大,胞质内含有大量脂滴。而Peli1-/--HFD组上述指标较WT-HFD组均显著改善。1.3与普通饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠血清中甘油三酯和游离脂肪酸水平均显著升高。Peli1敲除可以减少高脂饮食诱导的小鼠血清中脂质含量的增多2、Peli1敲除对小鼠肝脏中脂质聚积的影响小鼠肝脏的大体形态学显示,WT-HFD组小鼠肝脏肿大,色泽灰黄,表面油腻。而Peli1敲除改善了由高脂饮食引起的肝脏的这种改变,相对于WT-HFD组,体积变小色泽变红。小鼠的肝脏/体重比与上述结果一致。H&E染色和油红O染色显示,WT-Chow组小鼠肝细胞边界清楚,胞质内可见及少量脂滴。WT-HFD组小鼠肝细胞体积变大,胞质内存在较多脂滴。Peli1-/--HFD组的肝脏脂质沉积较WT-HFD组明显减少。3、Peli1敲除对小鼠基础能量代谢的影响高脂饮食喂养16周,TSE动物代谢测量分析系统发现小鼠产热量,氧气的消耗和二氧化碳的产生速率明显降低,而在Peli1敲除组的小鼠产热量,氧气的消耗和二氧化碳的产生速率明显高于野生型组。同时小鼠的摄食量,饮水量和运动各组并无显著性差异,提示Peli1敲除小鼠的代谢速率高于野生型小鼠。此外,高脂饮食16周小鼠夜间和白天的呼吸商都显著降低,在Peli1-/--HFD组白天的呼吸商进一步显著降低,而在白天Peli1-/--HFD组与WT-HFD组相比没有显著性差异。并且,Peli1敲除可有效上调白天小鼠的脂质氧化速率。白天小鼠处于静息状态,主要是内脏产热,提示Peli1敲除可增加组织对于脂质的利用。4、Peli1敲除对肝脏中HNF-4α的翻译后修饰的影响4.1 RT-PCR结果显示,Peli1对骨骼肌和棕色脂肪中脂质代谢相关基因的mRNA水平无显著影响,但肝脏中脂质代谢的相关基因在Peli1敲除后有较为明显的上升,尤其是 CPT1A,肉毒碱棕榈酰转移酶 Ⅱ（carnitine palmitoyltransferase,CPT2）,长链酯酰辅酶 A 脱氢酶（long-chain acyl-CoA dehydrogenase,lcad）,中链酯酰辅酶 A 脱氢酶（mediumchain acyl-CoA dehydrogenase,mcad）,PGC1α 等几个脂肪酸β氧化的关键酶和因子。揭示Peli1敲除可以有效促进肝脏脂肪的利用,增加产热和脂肪酸β氧化。同时RT-PCR结果也显示,高脂饮食组肝脏中HNF4α的mRNA水平明显降低,在Peli1敲除后得到显著逆转。4.2高脂饮食喂养16周,提取小鼠肝脏组织的总蛋白、胞浆蛋白和胞核蛋白,Western blot检测HNF4α的蛋白水平。与普通饮食组小鼠相比,高脂饮食组的HNF4α蛋白水平明显降低,而在Peli1敲除组小鼠肝脏中,HNF4α的蛋白表达异常增多。4.3给予原代肝细胞FFA或者poly（I:C）刺激,提取总蛋白和胞核蛋白,Western blot结果显示胞核里的HNF4α蛋白水平明显降低,在Peli1缺失后,HNF4α的表达显著增多。4.4给予蛋白酶体抑制剂（MG132或者ALLN）或者溶酶体抑制剂（chloroquine和 ammonium chloride）预处理的原代肝细胞 FFA（4 hr）或者 poly（I:C）（8 hr）刺激,发现蛋白酶体抑制剂可逆转FFA或者poly（I:C）刺激引起的HNF4α蛋白水平降低,而溶酶体则无明显影响。给予原代肝细胞MG132预处理,FFA（30min）或者poly（I:C）（1hr）刺激原代肝细胞,提取胞核蛋白,检测HNF4α的总的泛素化水平和K48位点泛素化水平,发现FFA或者poly（I:C）可显著增加HNF4α的总的泛素化水平和K48位点泛素化水平,在缺失Peli1后得到显著逆转。在HEK293细胞中,同样发现Peli1对于HNF4α的泛素化必不可少。二、Peli1敲除对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗具有改善作用1、在体实验1.1高脂饮食喂养16周,与普通饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠的空腹血糖和空腹胰岛素水平显著升高,在敲除Peli1后有明显缓解。葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验结果显示,Peli1敲除可逆转高脂饮食喂养小鼠的糖耐量异常以及胰岛素抵抗。葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验中各组的曲线下面积统计结果与上述结果一致。1.2 Western blot 结果显示,与 WT-Chow 组相比,WT-HF 组肝脏中 p-AKT（Ser473）水平明显下降,而p-IRS1（Ser307）和总的IRS1的丝氨酸磷酸化显著升高,在Peli1敲除后得到显著逆转。揭示Peli1敲除可以有效改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。2、体外实验2.1给予原代肝细胞时间点和浓度梯度的FFA刺激,Western blot结果显示500uM的FFA刺激细胞4hr,建立原代肝细胞胰岛素抵抗模型。与BSA对照组相比,FFA 可以明显增加 p-IRS1（ser307）水平,降低 p-tyr-IRS 1,p-AKT（Thr308）,p-AKT（ser473）水平,表明FFA可诱导原代肝细胞胰岛素信号通路损伤。Peli1敲除可以抑制上述FFA引起的原代肝细胞胰岛素抵抗。2.2给予原代肝细胞时间点的poly(I:（C）刺激,发现poly(I:（C）刺激8hr可诱导原代肝细胞胰岛素抵抗。同样Peli1敲除也可逆转poly（I:C）诱导的原代肝细胞胰岛素信号通路损伤。三、Peli1对FFA诱导原代肝细胞Traf3/MAPKs/炎症信号通路具有调控作用1、给予原代肝细胞FFA或者poly（I:C）刺激,FFA可明显诱导原代肝细胞中p-JNK和p-p38的水平增多,Peli1缺失可明显抑制p-JNK和p-p38的水平增多。然而,poly（I:C）对原代肝细胞中MAPKs的激活不明显。2、给予原代肝细胞FFA刺激,与对照组相比,FFA刺激组中Traf3的蛋白水平明显减少,Peli1缺失可逆转上述结果。此外,Peli1缺失可显著抑制FFA诱导的Traf3的K48位点的泛素化增多,同时减少cIAP2的泛素化水平。3、poly（I:C）并不能引起Traf3的蛋白水平减少;免疫沉淀结果显示poly（I:C）引起的是Traf3的K63位点的泛素化;此外poly（I:C）对cIAP2的蛋白表达和泛素化水平没有显著性影响。4、给予胚胎成纤维FFA、LPS或者poly（I:C）刺激,提取胞浆胞核蛋白,发现FFA、LPS或者poly（I:C）都可明显增加胞核里的总的IRF3或者p-IRF3的水平,减少胞浆里的p-IRF3水平。同样的,原代肝细胞中的结果与上述结果一致。此外,Peli1缺失可以逆转FFA、LPS或者poly（I:C）诱导的原代肝细胞中NF-κB的核转位水平增多。5、给予枯否细胞、原代肝细胞以及胚胎成纤维细胞FFA（2hr）或者poly（I:C）（4 hr）刺激,RT-PCR结果显示,FFA可引起促炎因子IL-1β、IL-6、TNFα、IL-12p40等的表达,在Peli1缺失后得到逆转,而poly（I:C）的作用较弱。结论综合动物及细胞实验,提示Peli1敲除显著的改善了高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗。其机制可能与与以下两方面有关:一方面,Peli1介导HNF4α泛素化和降解,调控脂质代谢基因表达有关。另一方面,Peli1通过调节c-IAP的泛素化激活和TFAF3泛素化降解,从而促进MAPKs的活化。因此,Peli1在饮食诱导的代谢调控中发挥着关键的作用。上述研究为临床寻找能够延缓代谢综合症进程的有效生物学靶点和创新药物的开发提供重要的理论依据。