前言骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种最常见的关节疾病，也是引起中老年人关节疼痛的最常见原因，严重影响中老年人的生活质量。近十年来，随着现代人活动频率和强度的增加，世界范围内OA的发病率出现了一个新特点，即发病年龄逐步年轻化。然而，临床上对OA患者的治疗，主要是缓解关节疼痛、改善功能以及人工关节置换术，目前尚缺乏从根本上控制和治疗OA的关键(软骨破坏和骨赘形成)的有效方法。OA涉及整个滑膜关节，包括软骨、滑膜及软骨下骨，这些组织的细胞都有相对独立的启动能力并引起OA的发生，无论最初的损伤是什么，其最后通路都是关节软骨的破坏、关节的重塑及软骨下的骨质硬化。OA发病机制至今尚不十分清楚，涉及全身及局部的许多因素，可能是一种综合的机制。研究表明，细胞凋亡参与了OA的发生发展。在OA关节软骨的一定区域尤其是钙化层，经常发现大量的空白区，被证实是细胞凋亡的结果。凋亡细胞的增多导致功能软骨细胞的减少，而且由软骨细胞合成的细胞外基质(ECM)蛋白合成也必然受累，这往往是OA软骨破坏的开始步骤。迄今为止，OA关节软骨中的细胞凋亡机制还不明确，随着越来越多的凋亡相关因子的发现，细胞凋亡的机制似乎更复杂。本研究即针对其中重要的三种凋亡相关因子：Fas，caspase-3，bcl-2。目的检测骨关节炎中关节软骨损伤重的部位和损伤轻的部位的Fas，caspase-3，bcl-2蛋白和mRNA的表达情况，明确这三种重要的凋亡相关因子在骨关节炎软骨损伤中的作用。方法软骨标本取自膝关节表面置换术中切下的OA患者胫骨平台软骨所有病例经临床和病理确诊，10例(男4例，女6例，年龄55—68岁)，共12膝(左侧5膝，右侧7膝)。分别剪取软骨损伤最轻(Min区)和损伤最重(Max区)的软骨组织块。大小约为1.5×1.0×0.5cm~3，观察软骨的大体外观形态。每个组织块垂直软骨面分成2块，随机用于制作石蜡切片和进行RT-PCR检测。石蜡切片制作前软骨组织块需经固定(10％中性甲醛溶液，24小时)和脱钙(草酸脱钙液，每日换液，21天)处理。对OA关节软骨石蜡切片进行H-E染色和番红O／固绿染色，并应用改良的Mankin关节软骨评分标准来评价OA关节软骨损伤的程度。应用免疫组化方法检测OA关节软骨Min区和Max区Fas，caspase-3和bcl-2蛋白的表达，PBS替代一抗作为阴性对照。显微镜下观察，并记数Min区和Max区Fas，caspase-3，bcl-2的阳性细胞率。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测OA关节软骨Min区和Max区软骨细胞的凋亡情况，用荧光素FITC-dUTP来标记，PI(碘化丙啶)复染，以不含末端脱氧核糖核酸转移酶的溶液替代作为阴性对照。荧光显微镜下观察，并记数OA关节软骨Min区和Max区的TUNEL阳性细胞率。应用RT-PCR技术检测OA关节软骨Min区和Max区Fas，caspase-3和bcl-2 mRNA的表达。Fas引物：上游5′-CTC CAA GGG ATT GGA ATT GA-3′，下游5′-TTG GTG TTG CTG GTG AGT GT-3′(序列号：NM 000043，扩增范围：440-838，长度：399 bp)。caspase-3引物：上游5′-TGG AAT TGA TGC GTG ATG TT-3′，下游5′-GTC GGC ATA CTG TTT CAG CA-3′(序列号：NM 004346，扩增范围：554-948，长度：395 bp)。bcl-2引物：上游5′-GGG TAC GAT AAC CGG GAG AT-3′，下游5′-CTG AAG AGC TCC TCC ACC AC-3′(序列号：NM 000633，扩增范围：516-910，长度：395 bp)。内对照为β-actin，β-actin引物：上游5′-GGC ATC CTC ACC CTG AAG TA-3′，下游5′-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3′(序列号：NM 001101，扩增范围：261-463，长度203 bp)。OA关节软骨组织经Trizol裂解液裂解，低温离心提取RNA，逆转录反应体系中逆转录，PCR反应体系中扩增(反应条件：预变性94℃4min,变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃1min，延伸72℃10min，30循环)，琼脂糖凝胶电泳，在紫外线摄像仪下观察并摄像，应用图像分析软件检测每条电泳带的平均灰度，与内参β-actin平均灰度的比值为各样本mRNA的相对值。采用简明统计分析10.34软件进行数据的统计分析，以P＜0.05为有统计学意义。结果OA关节软骨Min区为淡白色或淡黄白色，光滑，少数失去光泽而有小的裂隙。而在OA关节软骨Max区，软骨为淡黄色，表面粗糙不平，无光泽，出现较大裂隙，有的深达软骨下骨，软骨厚度变薄。H-E染色显示在OA关节软骨Min区软骨细胞较致密而均匀，少许的空泡样细胞。而在OA关节软骨Max区，软骨细胞数目减少而稀疏，空白区增多，较多空泡样细胞且空泡变大，可见细胞集聚现象。OA关节软骨番红O／固绿染色可见细胞核为棕黑色，细胞浆为绿色，细胞外基质为橙黄色。在OA关节软骨Max区较Min区番红O染色明显淡染。采用改良的Mankin关节软骨评分标准对OA关节软骨Min区和Max区进行评分，表明OA关节软骨损伤重的部位(Max区)评分值(7.08±1.00)明显高于软骨损伤轻的部位(Min区)(1.92±1.62)，有统计学意义(P＜0.05)。OA关节软骨石蜡切片免疫组化显示在Min区和Max区均可见Fas，caspase-3和bcl-2蛋白的表达，表现为棕黄色颗粒，PBS替代一抗的阴性对照无DAB显色。在OA关节软骨Max区，Fas，caspase-3，bcl-2阳性细胞率(％)(26.45±4.67，28.00±5.46，24.15±3.57)均明显高于软骨Min区(20.17±2.63，20.54±4.24，20.04±3.94)，有统计学意义(P＜0.05)，说明在OA关节软骨损伤重的部位Fas，caspase-3和bcl-2蛋白表达均高于软骨损伤轻的部位。TUNEL法检测表明OA关节软骨的Min区和Max区均可见TUNEL阳性细胞，荧光显微镜下表现为绿色荧光，TUNEL阴性细胞表现为红色PI荧光，阴性对照无FITC荧光。OA关节软骨Max区的TUNEL阳性细胞率(％)(31.36±5.86)明显高于软骨Min区(23.05±5.17)，有统计学意义(P＜0.05)，说明在OA关节软骨损伤重的部位与软骨损伤轻的部位相比，有更多的软骨细胞凋亡。RT-PCR检测表明OA关节软骨的Min区和Max区均可见Fas，caspase-3和bcl-2 mRNA表达，在紫外线下琼脂糖凝胶电泳图上表现为白色的均匀条带。在OA关节软骨Max区，Fas，caspase-3，bcl-2 mRNA表达的相对值(1.29±0.12，1.37±0.10，1.19±0.04)均高于软骨Min区(0.99±0.07，1.02±0.10，0.99±0.04)，有统计学意义(P＜0.05)，说明在OA关节软骨损伤重的部位Fas，caspase-3和bcl-2 mRNA表达均高于软骨损伤轻的部位，与三者蛋白表达情况一致。结论本研究表明OA关节软骨的Fas、caspase-3、bcl-2蛋白和mRNA表达以及凋亡细胞率与OA软骨损伤轻重程度相一致，说明细胞凋亡及凋亡相关因子参与OA关节软骨损伤，可能是OA的发病机制之一。对软骨细胞凋亡和凋亡相关因子进行适当调控，有可能成为治疗OA关节软骨损伤的有效途径。