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大肠癌(Colorectal cancer,CRC)是在环境或遗传等致癌因素作用下导致大肠黏膜上皮发生的恶性病变,是我国常见恶性肿瘤,具有较高的死亡率。目前大肠癌的治疗方式通常采用综合治疗方式,包括手术治疗、放疗、化疗和靶向治疗等一系列治疗方法。由于大肠癌肿瘤细胞的转移特性,预后效果仍然很差,并且这些疗法会产生严重的副作用,降低生活的质量。本实验室已从葫芦科藤本植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)的果实中提取得到一种抗肿瘤活性蛋白命名为TKP,研究发现,TKP可以通过PI3K/AKT信号通路和线粒体途径诱导人大肠癌细胞发生凋亡;并且还发现TKP可以通过调节PKM2来抑制STAT3/Snail1信号通路的传导,从而抑制大肠癌细胞的上皮间充质转化。此外,初步研究发现TKP能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进而抑制大肠癌细胞的迁移。本文进一步探究了TKP对大肠癌细胞迁移和侵袭的影响及机制。主要研究内容包括以下几部分:第一部分:栝楼抗肿瘤活性蛋白TKP对大肠癌细胞侵袭及迁移侵袭相关蛋白的影响。用不同浓度的TKP(终浓度为0、0.1、0.25和0.5μg/mL)分别处理大肠癌细胞系DLD1和HCT116细胞24 h后,采用Transwell侵袭试验检测两株细胞的侵袭能力,结果显示,TKP处理的两株细胞的侵袭能力显著降低。通过荧光定量PCR检测DLD1和HCT116细胞中MMP2的mRNA表达量,结果显示,随着TKP浓度的增加,两株细胞中MMP2的mRNA表达量都发生下调。采用Western印迹法分析DLD1和HCT116细胞中MMP2和MMP9的蛋白表达情况,结果显示,与对照组相比,随着TKP浓度的增加,MMP2和MMP9的蛋白表达量明显降低。明胶酶谱法检测两株细胞中MMP2和MMP9的蛋白活性,结果显示,TKP显著抑制了MMP2和MMP9的蛋白活性。这些结果表明TKP处理明显抑制大肠癌细胞的侵袭能力及迁移侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达和蛋白活性。第二部分:TKP通过Wnt/β-catenin信号通路抑制大肠癌细胞的侵袭及迁移侵袭相关蛋白的表达。用10 mM LiCl分别处理DLD1和HCT116细胞24 h,然后用0和0.5μg/mL的TKP分别处理两株细胞,采用荧光定量PCR检测大肠癌细胞系DLD1和HCT116细胞中MMP2的相对mRNA表达水平,结果显示,TKP通过Wnt/β-catenin信号通路抑制了细胞中MMP2的mRNA表达量。采用Western印迹法检测TKP对大肠癌细胞系DLD1和HCT116细胞中MMP2和MMP9蛋白表达情况的影响,结果表明,TKP和LiCl联合处理组细胞中的MMP2和MMP9的蛋白表达量比TKP单处理组高。采用明胶酶谱法检测大肠癌细胞系DLD1和HCT116细胞中MMP2和MMP9的蛋白活性,我们发现TKP和LiCl联合处理组与TKP单处理组相比,MMP2和MMP9消化明胶的能力有所升高。采用Transwell侵袭试验检测侵袭能力,结果表明,LiCl处理后,大肠癌细胞被TKP改变的侵袭能力降低的现象被明显逆转。以上结果表明,TKP通过Wnt/β-catenin信号通路抑制大肠癌细胞的侵袭及迁移侵袭相关蛋白的表达。第三部分:TKP通过Hedgehog/Gli1信号通路抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭。大肠癌细胞系DLD1和HCT116细胞分别采用不同浓度的TKP(终浓度为0、0.1、0.25和0.5μg/mL)处理24 h后,采用荧光定量PCR检测细胞中Gli1和Patched1的mRNA的表达水平,结果表明,经过TKP处理后,两株细胞中Gli1和Patched1的mRNA的表达均被下调。采用Western印迹检测两株大肠癌细胞中细胞质和细胞核中Gli1的蛋白水平,结果发现,细胞质和细胞核中Gli1的蛋白水平均被显著下调。然后采用Gli1过表达的方法来上调Hedgehog/Gli1信号通路,我们发现过表达Gli1后,TKP诱导的对MMP2和MMP9的mRNA的表达量、蛋白表达量和蛋白活性的抑制作用发生逆转;细胞划痕实验结果所示,Gli1过表达后,逆转了TKP对细胞迁移能力的抑制作用;Transwell侵袭试验结果表明,Gli1过表达,逆转了TKP对细胞侵袭能力的抑制作用。以上结果表明,TKP通过Hedgehog/Gli1信号通路抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭能力。综上所述,TKP通过抑制Wnt/β-catenin和Hedgehog/Gli1信号通路,进而下调MMP2和MMP9的表达及活性,最终抑制了大肠癌细胞的迁移和侵袭的能力。