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中国对虾(Fenneropenaeus chinensis),隶属节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),游泳亚目(Natantia),对虾亚目(Dendrobranchiata),对虾科(Penaeidae),明对虾属(Fenneropenaeus)。目前,中国对虾的育种方法主要依靠传统的人工选育,这种方法是根据中国对虾对环境的响应及耐受性的表型值进行选育的,传统选育需大批量的亲本,同时也存在很多无法确定性的因素,费时费力。可以与分子标记辅助选择育种(Molecular Marker-assisted Selection,MAS)结合,在选育优质新品种时得到了广泛的应用,其中,SNP标记作为第三代分子标记技术,有位点数量多,多态性丰富,能够稳定遗传,且检测方法简单快速等优点。目前,结合转录组的测序结果进行SNP位点的筛选及与相关性状的SNP标记关联分析已经成为重要的分子育种的研究方向之一。本研究在中国对虾转录组De novo测序的基础上,初步筛选得到967个SNP位点,再组建敏感组和抗性组进行BSA分析,利用直接测序法获得237个潜在的SNP位点后,利用荧光定量PCR法成功分型得到121个SNP位点,卡方检验结果显示有17个SNP标记与耐高pH性状显著相关(P<0.05),通过功能预测,共筛选到10个标记匹配到了序列相似度较高的功能基因。其中,C3073-1338TC位点所在基因为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),成功扩增FcNAGase的开放式阅读框(ORF)的DNA序列全长。具体研究内容如下:1.中国对虾转录组分析及SNP标记的高通量开发以正常养殖下的中国对虾为对照,每组设置3个平行,在高pH(pH=9.2)胁迫处理3h后的中国对虾的肝胰腺组织进行取样,采用Illumina Hiseq测序技术进行转录学测序及分析。共测了89.69Gb数据,组装并去冗余后获得62,772个Unigene,总长度,平均长度,N50以及GC含量分别为73,694,288bp,1,173bp,2,392bp和44.17%。数据过滤后使用Trinity软件对clean reads进行组装,组装的转录本中对照组和实验组分别为55,982条和45,027条;Unigene组装对照组和实验组分别为42,668条和35,263条,对照组和实验组的Unigene序列平均长度分别为992bp,895bp。将Unigene比对到七大功能数据库进行注释,最终分别有33,015(NR:52.60%),28,011(Swssprot:44.62%),15,175(COG:24.17%),26,128(KEGG:41.62%),19,557(Interpro:31.16%),4,113(GO:6.55%),29,426(NT:46.88%)Unigene获得功能注释,在前五个数据库中均获得注释生物有10,421(16.6%)条Unigene。对获得的Unigene进行GO分类,共有21,787个Unigene获得了GO信息,其中10,630条(48.8%)归入生物学过程,6,122条(28.1%)归入细胞组分,5,035条(23.1%)归入分子功能。这些结果弥补了中国对虾高pH胁迫基因组的相关信息,为研究中国对虾高pH胁迫机理提供了大量的数据支撑。转录组预测的SNP位点中,实验组和对照组中分别检测到49,215个和65,112个;针对同一个位点,实验组3次结果相同,对照组3次相同结果,但这两个结果不一致,即认为改为点为高突变率,初步获得与耐高pH性状相关的967个SNP位点,为下一步工作奠定基础。2.中国对虾SNP位点的开发及多态性分析高pH(pH=9.3±0.05)胁迫中国对虾后,选择早期死亡的48尾和后期死亡的48尾对虾分别组建敏感组和抗性组进行BSA分析。利用初步筛选的967个位点设计引物,通过直接测序法成功扩增出68,625bp的DNA片段,共筛选到237个潜在的SNP位点,SNP分布频率为0.35 SNPs/100bp,突变类型中转换(Transition)占62.44%(A/G占30.80%,C/T占31.64%),颠换(Transversion)占37.56%(A/C,A/T,C/G和G/T分别占10.12%,11.39%,3.38%和12.67%);再根据潜在的237个SNP位点设计特异性引物,利用荧光定量法进行对SNP位点进行分型,成功分型121个SNP位点;通过对其多态性分析,发现SNP位点的观测杂合度(Ho)范围为0.2737～0.9149,期望杂合度(He)范围为0.1119～0.5033,PIC值范围为0.1050～0.3750,低度多态性(PIC<0.25)的位点有26个,中度多态性(0.025
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