【摘 要】
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研究背景食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶性病变,其发病率和死亡率因地区而异,我国是食管癌发病率最高的地区之一。根据组织学类型,食管癌可以分为鳞癌和腺癌,在我国食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）占到 90%以上。尽管随着一系列诊治新技术应用于临床,在一定程度上改善了食管鳞癌患者的治疗效果,但食管鳞
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研究背景食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶性病变,其发病率和死亡率因地区而异,我国是食管癌发病率最高的地区之一。根据组织学类型,食管癌可以分为鳞癌和腺癌,在我国食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）占到 90%以上。尽管随着一系列诊治新技术应用于临床,在一定程度上改善了食管鳞癌患者的治疗效果,但食管鳞癌的五年生存率仍然不足25%,因此积极筛选食管鳞癌新的治疗靶点显得尤为重要。肿瘤的发生常与原癌基因的激活或者抑癌基因的失活有关,为了寻找与食管鳞癌相关的关键基因,我们利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库进行了分析,发现HOXC13在食管鳞癌中显著高表达,是一个潜在的促癌基因。HOXC13是Hox基因家族的一员,通常作为转录因子发挥作用,已报道与多种肿瘤的发生发展有关,但其在食管鳞癌中的功能和机制尚未报道。本研究将从细胞层面和临床样本出发,探究HOXC13在食管鳞癌中的表达水平及其与食管鳞癌患者病理特征之间的相关性:进一步通过体内外实验证实HOXC13对食管鳞癌增殖能力的影响,并深入探索其可能的分子机制,为食管鳞癌的诊断和治疗提供新的靶标。研究方法1.在TCGA数据库中研究HOXC13的表达与病人临床病理特征及生存期（Overall Survival,OS）的相关性,利用实时定量PCR验证HOXC13在配对食管鳞癌组织的表达水平及其与病人肿瘤大小、分期、有无淋巴结转移的相关性。进一步利用实时定量PCR及western blot验证HOXC13在食管鳞癌细胞系及正常食管上皮细胞中的表达。2.设计HOXC13的干扰或过表达质粒,利用CCK-8、RTCA细胞功能仪、克隆形成实验及TUNEL实验探究HOXC13对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响;利用裸鼠皮下荷瘤实验验证HOXC13在体内的功能。3.利用定量PCR及western blot探究HOXC13对凋亡关键基因CASP3的影响,使用caspase-3通路的抑制剂Z-DEVD-FMK观察HOXC13对食管鳞癌表型的影响是否依赖于CASP3。荧光素酶报告基因及ChIP实验检测HOXC13是否能与CASP3的启动子区直接结合。4.利用CCK-8、细胞功能仪、克隆形成、裸鼠皮下荷瘤实验及TUNEL实验探究miR-503对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响,荧光素酶报告基因实验检测miR-503是否能与HOXC13的3’-UTR区结合,组织样本中检测miR-503的表达及其与HOXC13的相关性。研究结果1.HOXC13在食管鳞癌组织中高表达且与病人的生存期明显相关,其高表达同时预示着更具侵袭性的临床病理特征。对于60对食管癌临床标本进行PCR验证,发现HOXC13在86.7%的食管鳞癌组织样本中表达升高,且与病人的TNM分期高度相关,而细胞层面的研究表明,HOXC13在食管鳞癌细胞系中的表达相较于食管正常上皮细胞显著升高。2.敲低HOXC13能显著抑制食管鳞癌细胞（ECA109和TE13）的增殖能力,并促进食管鳞癌细胞的凋亡,反之,过表达HOXC13能增强食管鳞癌细胞的增殖能力并抑制凋亡。裸鼠皮下瘤实验同样表明敲低HOXC13组的皮下瘤结节体积较对照小,肿瘤重量也轻。3.敲低HOXC13后凋亡关键基因CASP3的表达显著增高,利用caspase-3通路的抑制剂Z-DEVD-FMK处理后,能部分拯救敲低HOXC13对于增殖及凋亡的影响。荧光素酶报告基因及ChIP实验表明HOXC13能与CASP3的启动子区结合,抑制其转录。4.MiR-503在食管鳞癌组织样本中中显著低表达且与HOXC13表达呈负相关,过表达miR-503能抑制食管鳞癌细胞的增殖并促进凋亡,同时抑制HOXC13的表达,荧光素酶报告基因证实miR-503能与HOXC13的3’-UTR区结合。结论1.HOXC13在食管鳞癌中显著高表达,且与病人的临床病理特征及预后相关,有望作为食管鳞癌诊断及判断预后的分子标记物。2.HOXC13通过抑制CASP3的转录进而促进食管鳞癌的恶性增殖,HOXC13本身又受到miR-503的调控,miR-503-HOXC13-CASP3信号通路在食管鳞癌的恶性进展中扮演了重要作用,有可能作为治疗的靶点改善食管鳞癌病人的预后。
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