微生物降解四环素和土霉素的研究

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残留四环素、土霉素及其诱导产生的抗生素抗性基因(ARGs)在多环境介质中已被高检出。其中,尤其是养殖废水中不仅残留高浓度的四环素和土霉素,还含有高浓度的氨氮(NH4+-N)和硝酸盐(NO3--N),这将带来潜在的生态环境风险,因而选育降解四环素和土霉素且能够同时氮转化(生物脱氮)的菌种则是抗生素废水生物处理工艺的关键策略。本研究从活性污泥中经过长期驯化、筛选、分离出一株四环素土著降解菌和一株土霉素土著降解菌,并探究了降解菌的生理生化特性、生物降解特性、生物降解动力学特性、生物降解途径和机理、氮转化及碳影响效应、挂膜移动床生物膜反应器(MBBR)系统对模拟养殖废水中污染物的处理效能。得到主要研究结果如下:(1)采用生物学实验,研究了降解菌的生物学特性,包括生理生化特性、Biology分析、16 S rDNA测序、napA基因扩增。结果表明,四环素降解菌SQY5和土霉素降解菌KSS10分别被鉴定为Klebsiella sp.和Ochrobactrum sp.;菌株SQY5和KSS10分别可以利用34种和14种碳源,且均可以利用的碳源有D-海藻糖,蜜三糖,α-D-乳糖,D-半乳糖,乳酸钠等;细菌SQY5和KSS10的napA基因大小分别为860 bp和885 bp。(2)采用摇瓶批次实验,研究了初始四环素浓度/土霉素浓度、温度、接种量和pH分别对四环素和土霉素好氧生物降解特性的影响。采用响应曲面实验分别确定了细菌SQY5和KSS10对四环素和土霉素的最优好氧降解条件,最优条件为:初始四环素浓度为61.27 mg·L-1,温度为34.96°C,pH值为7.17,接种量为29.89%(v/v);初始土霉素浓度为56.31 mg·L-1、温度为32.48℃、pH值为5.45和接种量为16.07%(v/v)。动力学模型拟合结果表明,四环素和土霉素在不同四环素/土霉素初始浓度(10-100mg·L-1)、温度(20-40℃)和pH(5-10)条件下的生物降解均符合一级降解动力学:当四环素初始浓度、温度和pH分别为50 mg·L-1、35℃和8时,k值最大,分别为0.283h-1、0.209 h-1和0.176 h-1。当土霉素初始浓度、温度和pH分别为100 mg·L-1、35℃和5时,k值最大,分别为0.264 h-1、0.236 h-1和0.215 h-1。(3)采用摇瓶批次实验,分别探究了四环素和土霉素好氧生物降解和同步反硝化及氮转化特性。结果表明,细菌SQY5在8 h-104 h期间对四环素的还原率为0.175mg·L-1·h-1,最大硝化和反硝化率分别为1.06 mg·L-1·h-1和0.83 mg·L-1·h-1,此过程会产生大量腐殖酸,其在氮转化过程可作为碳源,四环素降解过程可能发生了C-O和C=O键断裂;细菌KSS10在0 h-120 h期间对土霉素和NH4+-N的去除效率分别为78.78%和56.14%,NO3--N几乎被完全转化,土霉素降解过程可能发生了脱-CH3、C-O和C=O键断裂。四环素和天然藻粉作为共碳源对四环素生物降解和氮转化的效能为0.11 mg?L-1?h-1和1.34 mg?L-1?h-1。(4)采用UPLC-Q-TOF MS(Micro)测定了细菌SQY5降解四环素的9种产物,推测四环素的生物降解过程主要经过了氧化、水解开环、脱羰基化(-C=O-)、脱胺基化(-NH2)、脱羟基化(-OH)和脱甲基化(-CH3)等途径;测定了细菌KSS10降解土霉素的9种产物,推测土霉素的生物降解过程主要是经过脱-OH、脱-CH3、水解开环、脱-C=O-和还原反应等途径。在自然条件下,探究了四环素生物降解产物对铜绿微囊藻的细胞毒性,发现高剂量的产物可以逐渐摧毁藻细胞的非酶促防御系统,最终完全丧失总抗氧化能力。通过软件PacBio RS II对细菌SQY5基因组进行测序,细菌SQY5基因组共包含5,006个基因,基因的总长度和平均长度分别为4,745,472 bp和948 bp;细菌SQY5含有13个基因岛,且基因岛含有假定蛋白、跨膜蛋白、分泌蛋白,还含有整合酶、转座酶等功能酶蛋白基因,以及含有核酸结合转录因子活性、解毒、催化活性等细胞膜表面结构活性相关的基因;细菌SQY5还含有多种酶基因参与四环素降解和氮转化过程(单加氧酶、过氧化物酶基因等)。采用UHPLC-QTOF-MS进行非靶标代谢组学测序,结果发现细菌降解四环素的代谢过程存在显著差异,且代谢过程显著增加了3个KEEG通路,为此,推断细菌SQY5降解四环素和氮转化过程的细胞代谢反应为:细胞合成代谢→细胞过程→环境信息处理→遗传信息处理→细胞分解代谢;此外,四环素生物降解和氮转化过程中ABC转运蛋白,氨酰-tRNA生物合成和2-氧羰基水杨酸代谢KEGG通路的富集结果均非常显著。(5)采用MBBR对模拟养殖废水的处理试验,结果表明,细菌SQY5挂膜MBBR系统具有良好的运行稳定性,通过适度提高碳源浓度,可以显著增加生物膜对污染物的去除效果,在纲水平上,Gammaproteobacteria,Bacteroidia,Clostridia和Alphaproteobacteria是系统中的主要物种。细菌KSS10挂膜MBBR系统在第四、五阶段预处理模拟养殖废水期间,全部氨氮几乎被去除,对土霉素降解率分别为1.338 mg?L-1?d-1和1.714 mg?L-1?d-1。本研究结果为深刻了解四环素和土霉素的微生物降解机制提供案例和依据,还可为养殖废水的生物处理提供技术支持。
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