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背景与目的尽管已经研究了近70年,急性胃粘膜病变(AGML)至今仍是危重病学领域面临的重大难题之一。作为应激反应的一个非特异表现,AGML的发生机制是多因素、多水平共同作用的结果,涉及到胃组织及肠神经系统层面、感觉传入神经、中枢神经系统三个解剖层面,伤害性应激可通过神经、内分泌、免疫等多种途径作用于这三个层面,从而引起AGML。近年来,一些离子通道和受体作为酸感受器、伤害性感受器对胃肠道伤害性应激的调控作用日益受到重视,在这些感受器中,酸敏感离子通道3(ASIC3)是目前的研究热点之一。前期研究表明,ASIC3作为酸感受器、伤害感受器在胃肠道信息处理过程中起重要作用。在实验大鼠中,投射胃的82%的DRG神经元有表达ASIC3。而在人的胃肠道中,在炎性肠病中ASIC3在肠粘膜上表达增加,在过敏性紫癜所致胃肠功能紊乱人群的胃粘膜上ASIC3也呈高表达性。但迄今为止,尚未有研究证实ASIC3在实验大鼠胃组织层面的表达情况；也没有研究系统阐述ASIC3在浸水束缚应激(WIRS)致AGML大鼠模型中胃组织层面、感觉传入神经通路、中枢神经系统三个解剖层面的时空分布模式；尚未有研究通过给予ASIC3特异性拮抗剂明确其在AGML的作用机制。故此,本研究拟通过建立WIRS致AGML模型,重点分析ASIC3在胃组织层面、感觉传入神经通路、中枢神经系统三个解剖层面的时空分布模式,并给予ASIC3特异性拮抗剂,明确其在AGML的作用机制,进一步阑明舒芬太尼对AGML的保护机制,旨在较全面的获取ASIC3参与和调控AGML形成的可靠证据,为确立ASIC3作为AGML防治的新靶点提供科学依据,也为围术期应激控制防治AGML的发生奠定坚实的基础。方法成年雄性SPF级Wistar大鼠(南方医科大学实验动物中心提供),随机分成6组：浸水束缚应激0小时组(WIRS0h组)或正常对照组(NC组),浸水束缚应激2小时组(WIRS2h组),浸水束缚应激应激4小时组(WIRS4h组),浸水束缚应激6小时组(WIRS6h组),舒芬太尼预先给药+浸水束缚应激6小时组(Sufen组),Toxin APETx2预先给药+浸水束缚应激6小时组(AT组)。采用浸水束缚应激法复制应激性胃粘膜损伤模型,分别于各对应时间点取出胃测定胃液pH值；胃组织MDA、SOD总活力；HE染色观察胃组织病理学改变；免疫组化染色及Westblot法检测ASIC3蛋白在胃组织、DRG神经元及下丘脑室旁核的染色定位及表达量；实时定量PCR法测定ASIC3mRNA在胃组织、DRG神经元及下丘脑的相对表达量。根据预实验及既往研究确定观测样本量,其中胃液pH值、HE染色、UI计数取8-10个样本,免疫组化染色及MDA、SOD总活力检测取6个样本,qPCR及Westblot法检测取4个样本。结果1.各组大鼠胃内pH值的变化与WIRS Oh组比较,余各时间段WIRS组的pH值均显著下降(P<0.05)；WIRS2h组、WIRS4h组及WIRS6h组组间比较无统计学意义(P>0.05),但WIRS4h组pH值略有回升。2.胃组织病理学检查光镜下WIRS0h组(NC组)胃粘膜结构正常,层次清楚。WIRS2h组：光镜下胃粘膜部分肿胀,胃粘膜少许溃疡灶,腺体间隙扩大,偶见部分溃疡灶点状出血。WIRS4h组：光镜观察可见胃粘膜水肿充血,有溃疡形成,表层粘膜部分坏死脱落,基底部可见部分胃腺组织缺失。WIRS6h组：大鼠胃粘膜大片状脱落及胃粘膜上皮细胞坏死,粘膜层有广泛的坏死组织及红细胞和大量的炎症细胞渗出,嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润于粘膜固有层,粘膜连续性中断并形成火山口状溃疡,溃疡甚至深达至肌层,出血明显。Sufen组：镜下可见胃粘膜肿胀,胃粘膜少许溃疡灶,腺体间隙扩大,表层上皮见小片状脱落,下层粘膜微循环淤滞,毛细血管充血于细胞间质,粘膜固有层局限损伤,未达肌层。AT组：受损粘膜较表浅局限,出血坏死较少,胃粘膜完整性较好,局部仍有单层柱状上皮细胞肿胀或缺如,粘膜下层毛细血管仍有血流淤滞现象。3.大鼠胃组织SOD、MDA检测与WIRS0h组(NC组)比较,其余各WIRS组、Sufen组及AT组的的SOD值均显著下降(P<0.05),且MDA值均明显升高(P<0.05)；随着WIRS时间的延长,SOD值的下降趋势及MDA值的上升趋势均明显,且组间比较有统计学意义(P<0.05)。与WIRS6h组比较,Sufen组及AT组的的SOD值均明显升高(P<0.05),且MDA值均显著下降(P<0.05)；与Sufen组比较,AT组的SOD值及MDA值表达变化均无统计学意义(P>0.05)。4. ASIC3免疫组化表达与定位WIRS0h组(NC组)胃组织ASIC3仅微弱阳性表达,偶见于粘膜上皮细胞层；WIRS2h组即可见全层胃粘膜呈棕黄色强阳性表达,主要分布于粘膜上皮细胞层、胃腺主细胞及壁细胞；WIRS4h组不仅可见全层胃粘膜呈棕黄色强阳性表达,粘膜下神经丛也呈阳性表达；WIRS6h组上皮细胞层破坏明显,棕黄色强阳性表达主要定位于胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛。Sufen组也有阳性表达,主要分布于上皮细胞层、胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛；AT组胃组织ASIC3呈弱阳性表达,仅在胃粘膜层表达。各组DRG神经元ASIC3免疫组化染色定位于神经元细胞上。WIRS Oh组DRG神经元细胞上可见ASIC3仅微弱阳性表达；其余各WIRS组ASIC3在DRG神经元细胞上呈棕黄色强阳性表达,其中以WIRS4h组棕黄色强阳性表达最明显。下丘脑PVN神经元ASIC3蛋白免疫组化染色结果：各组PVN神经元ASIC3蛋白免疫组化染色定位于神经元细胞膜及细胞浆。NC组可见大量棕黄色细胞染色；WIRS2h组及WIRS4h组仅见少量神经元细胞呈黄色染色；WIRS6h组、Sufen组及AT组神经元细胞棕黄色阳性表达细胞显著增多。5. ASIC3蛋白表达变化结果与WIRS Oh组(NC组)比较,其余各WIRS组、、Sufen组及AT组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高(P<0.05)；与WIRS2h组比较,WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高(P<0.05)；与WIRS4h组比较,WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值呈下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。与WIRS6h组比较,AT组的ASIC3蛋白灰度值显著下降(P<0.05), Sufen组的ASIC3蛋白灰度值略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠DRG神经元ASIC3蛋白Western blot结果如图1-12、1-13,表1-6所示,与WIRS Oh组比较,其余各WIRS组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高(P<0.05)；与WIRS2h组比较,WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值均显著降低(P<0.05)；与WIRS4h组比较,WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值表现为下降,且有统计学意义(P<0.05)。6. ASIC3mRNA荧光定量表达结果与WIRS Oh组(NC组)比较,其余各WIRS组、Sufen组及AT组的的ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS2h组比较,WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS4h组比较,WIRS6h组的ASIC3mRNA表达量表现为下降,且有统计学意义(P<0.05)。与WIRS6h组比较,AT组的ASIC3mRNA表达量显著下降(P<0.05), Sufen组的ASIC3mRNA表达量下降不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠DRG神经元ASIC3mRNA荧光定量表达结果：与WIRS Oh组比较,其余各WIRS组的ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS2h组比较,WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS4h组比较,WIRS6h组的ASIC3mRNA表达量表现为下降,且有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠下丘脑ASIC3mRNA荧光定量表达结果：与NC组比较,其余各实验组的ASIC3mRNA表达量均显著降低(P<0.05)；与WIRS2h组比较,WIRS4h组、WIRS6h组、Sufen组及AT组ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS4h组比较,WIRS6h组、Sufen组及AT组ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与WIRS6h组比较,Sufen组及AT组ASIC3mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与Sufen组比较,AT组ASIC3mRNA表达量无显著变化(P>0.05)。7.下丘脑PVN神经元c-fos蛋白免疫组化染色结果各组PVN神经元c-fos蛋白免疫组化染色定位于神经元细胞核上,c-fos免疫阳性细胞核呈深褐色,c-fos免疫阴性细胞核呈浅蓝色。NC组可见极少量褐色细胞核染色；WIRS2h组神经元细胞可见大量深褐色细胞核染色；WIRS4h组及WIRS6h组均可见中量的神经元深褐色细胞核染色;Sufen组及AT组可见少量的神经元深褐色细胞核染色。8.各指标间相关性分析ASIC3在胃组织及DRG神经元中的表达与胃内PH值及胃组织SOD值呈显著负相关,与胃组织MDA值呈显著正相关；胃组织ASIC3表达量与DRG神经元ASIC3表达量呈显著正相关。下丘脑ASIC3mRNA表达及PVN ASIC3免疫阳性细胞数与PVN c-fos蛋白免疫阳性细胞数呈显著负相关。结论1. WIRS时间与胃粘膜损伤程度密切相关,随着WIRS时间延长,胃粘膜损伤进行性加重,在AGML发展过程中,胃液的持续性酸化,胃组织氧化性损伤加重,抗氧化能力减弱是AGML进行性加重的重要因素。为复制严重出血性坏死性急性胃粘膜损伤模型,应至少给予大鼠6小时的浸水束缚应激。2.本研究首次系统阑述了ASIC3在胃组织的表达情况：ASIC3微弱阳性表达于大鼠胃组织中,WIRS2h即可使ASIC3在全层胃粘膜呈阳性表达；WIRS4h不仅可见ASIC3在全层胃粘膜强阳性表达,粘膜下神经丛也呈阳性表达；WIRS6hASIC3的棕黄色强阳性表达主要定位于胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛。3.本研究系统阑述了ASIC3在大鼠投射胃的DRG神经元的表达情况：ASIC3可呈微弱阳性表达于神经元细胞上,WIRS可使这些DRG神经元上ASIC3呈高表达性,其中以WIRS4h时ASIC3的强阳性表达最明显。WIRS6h时ASIC3的阳性表达已较WIRS4h显著下降,但仍显著高于正常状态。4.本研究系统阑述了ASIC3在下丘脑室旁核神经元的表达情况及对神经元活动的影响：ASIC3高表达于正常大鼠的下丘脑中,ASIC3免疫阳性细胞广泛分布于PVN中。大鼠浸水束缚可使下丘脑ASIC3mRNA表达量减少,抑制ASIC3蛋白在PVN神经元的高表达,且其变化趋势与c-fos蛋白表达量显著负相关,提示WIRS时下丘脑ASIC3的变化可能与其神经元的电活动有关。5.通过腹腔内给予ASIC3特异性拮抗剂APETx2预先给药,首次证实APETx2通过下调胃组织ASIC3的表达,并通过抗氧自由基作用起胃粘膜保护作用。确证了胃组织ASIC3是调控伤害性应激的关键性因子。由于下丘脑ASIC3的作用机制尚未清楚, ASIC3在中枢层面对WIRS的调控作用尚需进一步研究。6.通过腹腔内给予舒芬太尼预先给药,明确舒芬太尼预先给药通过抗氧自由基作用起胃粘膜保护作用的同时,并未减少胃组织ASIC3的表达,提示舒芬太尼在胃组织层面的抗伤害性应激作用可能存在其他机制。而中枢层面上,舒芬太尼抑制WIRS诱导的下丘脑神经元活动,缓解WIRS导致的下丘脑ASIC3表达抑制,这可能是舒芬太尼对WIRS导致的AGML起保护作用的中枢机制。值得进一步探索。