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枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是一种起源于中国的亚热带常绿果树,因其果实香甜可口、营养颇丰而受到消费者喜爱。随着枇杷栽培面积的增加,大面积叶部病害的发生成为限制枇杷优质高产的主要因素。枇杷叶斑病种类繁多,生产中由于病斑形态相似,且存在多种病原菌混合致病的现象,故无法通过传统病原鉴定法全面、快速、准确地鉴定其病原菌种类。我国枇杷主要叶斑病有灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病和圆斑病等,本研究以上述5种病害为研究对象,通过结合传统分离鉴定法(包括菌落特征及孢子形态观察、rDNA-ITS序列分析和致病性测定)和Miseq高通量测序技术,以期更为准确地鉴定病原,并明确不同病害微生物多样性的年周期变化及地域分布差异,为枇杷叶斑病的防治奠定基础。主要研究结果如下:1.分别采集重庆地区5种主要叶斑病不同时期(春、夏、秋梢生长时期)的病样进行传统分离培养,病原菌种类鉴定及其分离频率统计结果显示,枇杷叶斑病不是单一致病菌引起,而是由多种病原菌混合导致。可能引起灰斑病的病原菌为Colletotrichum(40.00%)、Alternaria(20.00%)、Phoma(10.00%)、Pestalotiopsis(6.67%);可能引起轮纹病的病原菌为Leptosphaeria microscopica(6.67%),该菌为国内首次报道;可能引起炭疽病的病原菌为Alternaria(19.23%)、Phoma(17.95%)、Pestalotiopsis(15.38%)、Colletotrichum(14.10%);可能引起叶尖枯斑病的病原菌为Alternaria(23.91%)、Colletotrichum(21.74%)、Phoma(16.30%);可能引起圆斑病的病原菌为Colletotrichum(40.98%)、Alternaria(18.03%),且同一病害不同时期的病原菌分离频率不同。2.利用传统分离鉴定法对重庆地区不同时期病原菌的多样性进行分析,从中共分离得到365个菌株,隶属于23个属,主要为子囊菌门Ascomycota(98.08%)和担子菌门Basidiomycota(1.92%),其中高频分离(分离频率>5%)菌属有:Colletotrichum(24.66%)、Alternaria(20.00%)、Phoma(13.70%)、Pestalotiopsis(11.23%)、Epicoccum nigrum(5.21%)及Fusarium(5.21%)。其中春、夏、秋梢生长时期分离频率最高的菌属不同,分别为Phoma(23.16%)、Alternaria(26.47%)、Colletotrichum(41.79%),表明重庆地区不同时期优势致病菌种类不同。3.利用传统分离鉴定法对不同地区(重庆、四川、福建)秋梢生长时期5种主要叶斑病病原菌进行分离鉴定,从中共分离获得242个菌株,隶属于16个属,高频分离菌属有Colletotrichum(53.11%)、Pestalotiopsis(12.81%)、Fusarium(10.74%)、Phoma(7.44%)、Alternaria(5.79%)。不同地区病原菌的分离频率存在差异,但菌群种类组成相似,尤其是优势菌属组成,不同地区分离频率最高的均为Colletotrichum,分离频率分别为48.75%、60.53%、51.16%。表明不同地区枇杷叶斑病病原菌多样性差异不明显。4.采集重庆地区不同时期5种主要叶斑病病样,利用Miseq测序平台对病斑真菌多样性进行高通量测序分析。结果显示:(1)病斑真菌主要为Ascomycota(78.33%)和Basidiomycota(19.39%),隶属于260个属,其中24个(如Pestalotiopsis、Colletotrichum、Alternaria)为优势属(相对丰度>1%),占总菌属相对丰度的88.38%;(2)不同时期病样菌群组成不同,春梢病样共获得147个属,其中优势属13个;夏梢病样共获得162个属,其中优势属16个;秋梢病样共获得157个属,其中优势属16个。三个时期共享菌属有85个,其中8个为优势共享属,其相对丰度之和分别占各自时期总测序量的53.67%、57.31%、78.9%;(3)主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)显示同一病害不同时期菌群组成及其相对丰度不同,与传统分离结果基本一致。5.利用Miseq测序技术对不同地区秋梢生长时期5种主要叶斑病真菌多样性进行分析,结果显示:(1)病斑真菌隶属于223个属,其中有27个优势属,占总测序量的85.20%;(2)不同地区枇杷主要叶斑病菌群组成不同,重庆地区共测得156个属,其中优势属16个;四川地区共测得135个属,其中优势属14个;福建地区共测得133属,优势属15个。三个地区共享菌属共有75个,其中4个为优势共享属,分别为:Pestalotiopsis、Ascochyta、Colletotrichum及g__k__Fungi(未注释菌属);(3)福建地区枇杷病害样本与重庆、四川地区差异显著(P<0.05),优势菌属的组成及丰度差异明显,g__f__Glomerellaceae、Chaetospermum、Cladosporium、g__o__Pleosporales四个属的相对丰度差异最明显。综上所述,枇杷叶斑病并不是由单一致病菌引起,而存在混合致病现象。本研究首次将Miseq高通量测序技术应用于枇杷病害病样真菌群落组成及多样性分析,测序结果与传统分离鉴定结果显示,同种病害样本在同一地区不同时期以及不同地区同一时期的菌群组成及相对含量均存在差异,且Miseq测序技术能够获得更为详细、全面的菌群组成信息,说明Miseq高通量测序技术可用于植物病害真菌多样性分析,通过与传统分离鉴定方法相结合,可及时预测并诊断真菌病害,为病害的有效防治提供保障。