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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区主要的海产蟹类之一,隶属于甲壳纲,青蟹属。由于性成熟的雌蟹(膏蟹)在营养、经济、医药等多方面的价值,日益受到消费者和研究者的青睐。近年来,研究者对如何在青蟹养殖过程中获得优质的膏蟹进行了大量研究,并取得了一定进展。甲基法尼酯(Methyl farnesoate,MF)是调节拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中重要的内分泌激素,在青蟹性成熟的过程中起着至关重要的作用。甲基法尼酯在拟穴青蟹大颚器(Mandibular organ,MO)合成后,在进入靶器官发挥作用的过程中需要借助甲基法尼酯结合蛋白(Methyl farnesoate binding protein,MFBP)的保护和运输,防止被特异的酯酶降解。特异的羧酸酯酶能够水解MF,对控制MF的滴度平衡起着至关重要的作用。因此对拟穴青蟹MF代谢过程中相关基因的研究对了解甲壳动物的内分泌调控机制具有良好的指导意义。本研究基于拟穴青蟹的转录组数据,拟从分子生物学的角度,对拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中与MF代谢相关的保幼激素结合蛋白(Juvenile hormone binding protein,JHBP)和保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)基因家族进行了克隆和表达模式分析,获得的主要研究成果如下:1.拟穴青蟹Sp-JHBP的克隆和表达分析JHBP蛋白是一类在保幼激素(Juvenile hormone,JH)信号传导通路上承担保护/运输等重要作用的一类蛋白家族,是JH代谢系统中关键的组成元素。本研究在拟穴青蟹中克隆获得七条JHBP,具有JHBP结构域,分析后命名为Sp-JHBP,七条ORF最长为1,326 bp,最短为663 bp,编码221-441个氨基酸,预测蛋白分子量为24,157-48,188 Da,等电点4.10-5.77。只有Sp-JHBP1不含信号肽。七条Sp-JHBP序列的一致性为38.96%。七条Sp-JHBPs的二级结构包括26.0-39.7%的α-螺旋(alpha helix),28.5-47.6%的链(strand),以及25.0-31.8%的环(loop),除Sp-JHBP5外,均含有2-6个蛋白结合区域。经分子对接模拟预测,七条Sp-JHBP蛋白的三级结构均能结合MF。荧光定量PCR分析表明7个基因在溞状幼体I-V(Z1-Z5)、大眼幼体(M)、仔蟹(C1-C2)8个幼体发育阶段几乎都有表达,但Sp-JHBP1和Sp-JHBP5表达量很低。Sp-JHBP2在Z1期表达量最高,Z2-Z4溞状幼体几乎检测不到表达,随后在Z5-C1变态发育期出现较高的表达量。Sp-JHBP3和Sp-JHBP4具有相似的表达模式,在Z5和M期表达量很低,在C1期出现较高的表达。Z5和M期这两个时期是青蟹幼体变态过渡阶段,我们推测,Sp-JHBP3和Sp-JHBP4可能与MF功能有关。组织分布结果显示,Sp-JHBP2主要表达于卵巢组织,Sp-JHBP3,4,5,6,7最高表达量均出现在肝胰腺中。MF成体诱导实验表明,MF能抑制卵巢中Sp-JHBP2的表达,对肝胰腺中Sp-JHBP3,4,5,6,7的表达影响不显著。MF诱导大眼幼体实验结果显示,MF明显上调了Sp-JHBPs的表达,其中以0.1μM上调效果最为显著。以上结果说明青蟹Sp-JHBPs受MF的调控。2.拟穴青蟹JHE的克隆及表达分析JHE是存在于节肢动物体内的羧酸酯酶家族成员,对维持生物体内内分泌激素-JH滴度的平衡具有非常重要的作用。本研究在拟穴青蟹中克隆获得4条JHE序列,结合本实验室之前的研究,共十一条JHE,该十一条基因序列的相似性较高,为52.56%,分析后命名为Sp-JHE。它们的cDNA序列全长介于1,594-4,371 bp之间,ORF介于720-1,797 bp之间,编码239-598个氨基酸,预测蛋白质的分子量为26,488-66,729Da,等电点为5.02-6.29。除了Sp-JHE5,8-11之外,其他六个Sp-JHE在N端含有大约17-22个氨基酸残基的信号肽序列。进化树结果表明拟穴青蟹中推测的Sp-JHEs和甲壳动物拟长额虾属(Pandalopsis japonica)中两条JHE氨基酸序列聚为一大支,显示遗传距离较近。Sp-JHEs转录本结果显示不同的分布特征,Sp-JHE2、6、11几乎在所有的组织中都有所表达,其中Sp-JHE2在肌肉和脑神经节中表达量较高,Sp-JHE6、11在上皮细胞中表达量最高。Sp-JHE3只在胸神经节和上皮细胞中表达,且在上皮细胞中的表达量要远远高于其他几个基因。在卵巢组织中,除Sp-JHE3外,另外几个Sp-JHEs都有表达,其中以Sp-JHE10的表达量为最高,Sp-JHE6、7次之。Sp-JHE7在卵巢和肝胰腺中表达量较高,在其他几个组织中或微量表达,或检测不到表达量。Sp-JHE8在肝胰腺中表达量较高。Sp-JHE10在大颚器和肝胰腺组织中的表达量最高。幼体发育表达显示Sp-JHE3只在Z3、Z4、M和C1期有表达,且表达量呈现逐渐上升的趋势,到C1期达到最高,推测Sp-JHE3主要在拟穴青蟹生长发的后期起作用。Sp-JHE6在受精卵到M期都有表达,呈先上升后下降的趋势,在Z4期达到最高。可能表明Sp-JHE6可能比Sp-JHE3作用更广泛。我们同时检测了JHE的调节基因JHEBP的体内表达模式,发现Sp-JHEBP在所检测的拟穴青蟹幼体的各发育阶段及8个组织中都有表达,其中在上皮细胞中表达量最高,与Sp-JHE3一致,推测Sp-JHEBP可能参与拟穴青蟹的蜕皮调控。综上所述,本研究克隆获得两种与MF代谢相关的两种基因Sp-JHBP和Sp-JHE序列,然后做了相关的生物信息学分析,并对它们在拟穴青蟹中的表达模式进行了研究。研究结果表明,Sp-JHBP和Sp-JHE可能参与了拟穴青蟹的幼体生长发育和繁殖调控,这些基础研究对进一步揭示甲壳动物的内分泌调控机制提供了数据支撑。