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血小板生成素(thrombopoietin,TPO)与TPO受体Mpl(myeloproliferativeleykemia)结合激活信号通路,促进巨核细胞系分化、增殖。目前,世界上有大量血小板减少症(thrombocytopenia)病人,无论是传统的血小板输注法,还是新兴的TPO治疗法,治疗效果都不理想,会引起免疫反应和其他副作用。寻找一种特异性好、疗效佳、毒副作用低的治疗血小板减少症药物已成为世界上一个迫切的课题。
此前,本实验室以Mpl胞外区为诱饵,利用酵母双杂交系统从人胎肝cDNA文库中筛选到一枚与TPO没有同源性的Mpl新配体-NUDC,与人核迁移蛋白(human nuclear distribution protein C,hNUDC)序列相同,后来通过毕赤酵母表达系统表达出与hNUDC同源的小鼠NUDC(mNUDC)。本论文以BAIB/c小鼠为研究模型,首先研究mNUDC在体内外的生物活性及其与TPO的作用关系,接着采用半定量RT-PCR方法检测了不同成熟阶段巨核细胞内mpl、tpo、mnudC基因的表达情况,最后构建了pAd/CMV/V5-DEST-hNUDC腺病毒表达载体以实现hNUDC在细胞内的过量表达。
mNUDC和TPO连续注射小鼠7天,抽血检测循环血小板含量,发现mNUDC和TPO均能增加血小板的含量,TPO(2.5μg/kg/day)单独作用的效果比mNUDC好,mNUDC单独注射时10.0μg/kg/day的剂量产生最好的效果,TPO与2.5μg/kg/day剂量mNUDC组合注射时的效果优于mNUDC或TPO单独作用,注射后第10天血小板含量达到高峰,此时是正常水平的2.5倍。
用mNuDC和TPO处理分离自小鼠的骨髓细胞,结果显示TPO(20 ng/mL)作用产生的增殖效果比mNUDC好,单独作用时0.1μg/mL的mNUDC产生最佳效果,乙酰胆碱酯酶染色法染色巨核细胞,发现培养5天后mNuDC处理的巨核细胞着色较TPO组深,说明细胞更成熟,TPO与0.05μg/mL的mNUDC组合处理骨髓细胞产生的增殖效果比mNUDC或TPO单独作用好,且里面有很多前血小板状态的巨核细胞,巨核细胞的成熟程度TPO高。用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)密度梯度法分离得到不同成熟程度的巨核细胞,半定量RT-PCR法检测mpl、tpo、mnudC基因的表达情况,结果显示mpl、tpo、jmnudC基因在未成熟和成熟的巨核细胞内均有表达,tpo基因的表达量较低,在两种细胞中几乎均等,mpl和mnudC基因的表达量都很高,且都是成熟状态细胞中表达量较高。
最后成功构建了pAd/CMV/V5-DEST-hNUDC腺病毒表达载体,为将来实现细胞内hNUDC过量表达以及带有其他基因的腺病毒载体的构建提供基础和技术支持。
综合实验结果,mNUDC作为TPO受体Mpl的一枚新配体在体内能增加血小板的产生,在体外能促进巨核细胞的增殖、成熟、分化成血小板,虽然它增加血小板数量和促进巨核细胞的增殖作用不如TPO,但无论在体内还是体外,相当浓度的mNUDC能和TPO协同作用促进巨核细胞的增殖、发育、成熟和分化产生血小板。结果初步显示TTO主要在巨核细胞发育前期增殖阶段起作用,而mNUDC则主要在发育后期胞质成熟,乃至血小板释放的阶段起不可或缺的作用。